Практикум. 
Микробиология: теория и практика

Вопросы и задания для самоконтроля.

• 1. Расположите в ряд следующие продукты (от самого быстро портящегося к наименее подверженному микробной порче): замороженное мясо, селедка в пластиковой упаковке, консервированная томатная паста в жестяной банке, порошок растворимого кофе, сачат оливье, леденцовые конфеты, пирожное эклер.
• 2. Сравните известные вам способы предохранения продуктов от порчи по эффективности и доступности.
• 3. Почему опасно носительство патогенных микроорганизмов у работников, имеющих дело с пищевыми продуктами?
• 4. Как соблюдение требований гигиены может приостановить порчу пищевых продуктов? Приведите примеры.
• 5. Какие заболевания могут возникать при употреблении испорченного зерна и продуктов из него?
• 6. Из-за чего возникают «болезни» вина и пива?
• 7. Какие процессы иногда приводят к порче квашеных продуктов и силоса?
• 8. Проанализируйте факторы, влияющие на процесс порчи основных сельскохозяйственных продуктов. Какие способы защиты для них применяют?
• 9. Какие функциональные группы микроорганизмов участвуют в биоповреждении трубопроводов при транспортировке нефти?
• 10. Какие факторы влияют на скорость биокоррозии?
• 11. Какую роль в процессах биокоррозии могут играть разные группы микроорганизмов?
• 12. Какие возбудители могут вызывать пищевые токсикоинфекции?
• 13. Для каких заболеваний характерно явление незавершенного фагоцитоза?
• 14. Почему опасна хозяйственная деятельность на месте древних сибиреязвенных скотомогильников?
• 15. Почему при попадании в открытую рану почвы велика вероятность развития анаэробных инфекций?
• 16. Назовите заболевания, передающиеся половым путем.
• 17. Почему СПИД называют чумой XX в.
• 18. Перечислите способы выявления возбудителя инфекционного заболевания.
• 19. Что показывают кожные пробы?
• 20. Как с помощью соблюдения правил гигиены можно замедлить распространение инфекционных заболеваний?
• 21. Какие формы искусственного иммунитета формируют в условиях эпидемии у здоровых и заболевших людей?
• 22. Что способствовало возникновению множественной лекарственной устойчивости?
• 23. Какие последствия может вызвать отказ от прививок?
• 24. Назовите санитарно-показательные микроорганизмы, определяемые при исследованиях воды, воздуха, почвы.
• 25. Почему сильное загрязнение фекалиями говорит о вероятности присутствия в пробе патогенных микробов?
• 26. Почему для разных продуктов установлены разные нормативы микробной обсемененности?

Семинар 1

Участие микроорганизмов в порче пищевых продуктов

Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных по ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Лабораторная работа 1

Микробная порча продуктов (на примере хлебобулочных изделий)

Цель работы: в результате проведенной работы студенты изучат процесс порчи хлеба плесневыми грибами, а также факторы, влияющие на его скорость и глубину. Аналогичным образом можно наблюдать процесс порчи других видов продуктов.

Необходимые материалы (на 1 студента): 3 пипетки на 1—2 мл; колба с 20 мл сахарной воды; колба с 20 мл лимонного сока; колба с 20 мл водопроводной воды; 4 куска свежего белого хлеба; 4 куска хлеба разных сортов (серого, черного, зернового, с наполнителями); 8 небольших прозрачных полиэтиленовых пакетов; маркер; липкая лента.

Перед началом опыта готовят сахарную воду, растворяя ¼ чашки сахара в ¼ чашки подогретой водопроводной воды (подогревать, но не кипятить). Сироп охлаждают до комнатной температуры. Маркируют 4 п/э пакета следующим образом: 1 — «Сухой белый хлеб», 2 — «Влажный белый хлеб», 3 — «Белый хлеб с лимонным соком», 4 — «Белый хлеб с сахарной водой».

Моют руки с мылом, помещают кусок белого хлеба в 1-й пакет и заклеивают его клейкой лентой. С помощью пипетки вносят на второй кусок хлеба 20 капель водопроводной воды (хлеб должен быть влажным, но не мокрым), помещают его во 2-й пакет, который также заклеивают клейкой лентой. Другой пипеткой наносят 20 капель лимонного сока на третий кусок хлеба и вкладывают его в 3-й пакет. Отдельной пипеткой смачивают четвертый кусок 20 каплями сахарной воды и помещают его 4-й пакет. Не следует касаться пальцами областей, смоченных различными жидкостями. Повторяют описанные процедуры для других выбранных сортов хлеба, пометив соответствующим образом п/э пакеты. Убедившись, что все пакеты герметично закрыты, их помещают в термостат на 30 °C. Ежедневно в течение двух недель проверяют пакеты, записывая результаты наблюдений в лабораторный журнал в виде таблицы (табл. 18.7) и делая зарисовки картины внутри пакетов, не открывая их.

Таблица 18.7

Развитие плесени на белом хлебе в разных условиях.

Строят графики по результатам эксперимента для каждого варианта, выражая рост плесени в % площади куска хлеба на каждые сутки инкубации (рис. 18.5).

Рис. 18.5. Развитие плесени на белом хлебе в разных условиях.

Аналогичные таблицы и графики составляют для других сортов хлеба, взятых в эксперимент. Сравнивают результаты порчи хлеба разных сортов с различными добавками и делают выводы о том, какие факторы влияют на состав поражающих хлеб плесневых грибов и на скорость процесса порчи хлеба.

Лабораторная работа 2

Действие природных антимикробных веществ, содержащихся в приправах, на микроорганизмы

Цель работы: при выполнении данной задачи студенты увидят, что в различных вкусо-ароматических добавках и пряностях могут присутствовать вещества, обладающие ингибирующим действием на рост микроорганизмов.

Использование ароматических и улучшающих вкус пищи приправ не только влияет на органолептические свойства продукта, но и может оказывать ряд других полезных эффектов. Многие из них содержат антиоксиданты, снижающие количество свободных радикалов в крови. Ароматические вещества других пряностей уже в течение нескольких столетий используют в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности. В настоящее время их применяют в качестве дезинфектантов с «лимонным» запахом и компонентов разогревающих мазей, зубных паст, пищевых ароматизаторов, духов, дезодорантов, мыла и других средств личной гигиены. Большинство продуктов предохраняют от порчи, добавляя различные химические соединения, однако добавление пряностей часто также может продлить срок хранения пищи, не нанося ущерба здоровью потребителя. Именно поэтому в последние годы в значительной степени возрос интерес к натуральным вкусо-ароматическим веществам.

Для успешного проведения данного эксперимента необходимо использовать только достаточно свежие индивидуальные пряности, без примеси других ингредиентов.

Необходимые материалы (на одного студента): культура Bacillus subtilis на скошенном агаре в пробирке, чашки Петри со стерильным МПА (из расчета, одна чашка — контрольная и по одной чашке на каждую исследуемую пряность), микробиологическая петля, горелка или спиртовка, различные пряности, маркер, каталожная карточка, сосуд с дезинфектантом.

Перед постановкой опыта оценивают уровень аромата каждой пряности в соответствии со следующей шкалой («-» — нет запаха, «+» — слабый запах, «++» — сильный запах, «+++» — очень сильный запах). Маркируют закрытые чашки Петри, указав на донцах ближе к краю вариант опыта. Поверхность рабочего стола тщательно протирают дезинфектантом. Каждую чашку с МПА засевают культурой В. subtilis у пламени горелки, набирая клетки петлей со скошенного агара и проводя ей плашмя и близко друг к другу горизонтальные штрихи по агару в чашке. Затем чашку поворачивают на 90° и проводят той же петлей горизонтальные штрихи перпендикулярно уже сделанным. На крышках закрытых опытных чашек Петри проводят маркером линию по диаметру чашки. Чашки переворачивают вверх дном. В данном положении они будут оставаться до конца эксперимента.

Дно первой опытной чашки поднимают и, не переворачивая, кладут рядом с крышкой. На одну половинку открытой крышки первой опытной чашки Петри осторожно помещают первую изучаемую пряность. Пользуясь каталожной карточкой и держа ее вертикально, распределяют пряность равномерно по половине крышки чашки, не заходя за линию, проведенную маркером. Предельно осторожно, не сдвигая пряность, помещают дно первой опытной чашки Петри на ее крышку. Маркером наносят на дно чашки линию, продолжающую линию на крышке. Обозначают ту половину дна чашки, которая находится над пряностью. Проделывают аналогичные процедуры для других опытных чашек и исследуемых пряностей. Осторожно помещают чашки в термостат при 25—30°С на 1—2 сут.

По окончании инкубации рассматривают контрольную и опытные чашки, сравнивая характер роста культуры в них, и регистрируют влияние каждой пряности на рост культуры в соответствии со следующей шкалой: «-» — нет эффекта (рост такой же, как и на контрольной чашке); «+» — слабое действие (немного меньше бактерий по сравнению с контролем); «++» — сильное действие (зона над пряностью свободна от бактерий); «+++» — очень сильное действие (зона над пряностью и вдали от нее свободна от бактерий). Результаты вносят в табл. 18.8.

Таблица 18.8

Аромат и антимикробное действие испытанных приправ

Если было испытано много пряностей, составляют общую для группы студентов таблицу (табл. 18.9), объединяющую пряности по характеру их действия на культуру.

Таблица 18.9

Группы пряностей, имеющие разную степень антимикробного действия

Делают выводы о корреляции силы аромата и уровня антимикробного действия пряностей.

Семинар 2

Санитарно-бактериологический анализ пищевых продуктов, воды и воздуха. Микробное число, санитарно-показательные микроорганизмы, коли-титр, коли-индекс

Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных, но ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Лабораторная работа 3

Определение возможного источника заражения и действие на него дезинфектанта

Цели работы: при выполнении данного опыта студенты научатся приемам определения и проверки источника заражения на наличие микроорганизмов и изучат действие на них дезинфектантов.

Термином «источник заражения» обозначают любой неживой объект, содержащий болезнетворные микроорганизмы. Практически все вещи, окружающие нас в повседневной жизни, а также живые существа нестерильны, т. е. содержат микроорганизмы на поверхности и внутри. Большинство из них безвредны для человека, однако встречаются и патогенные. Шансы получить инфекционную болезнь возрастают с увеличением концентрации микробных клеток в окружающей нас среде. Основными способами ее снижения служат соблюдение правил гигиены и использование дезинфицирующих веществ.

Необходимые материалы (для каждого проверяемого объекта): 3 стерильные чашки Петри с МПА, 3 стерильные ватные палочки, пинцет, бумажные полотенца или салфетки, маркер по стеклу, дезинфицирующее вещество (70%-й этанол, 10%-й отбеливатель, жидкое мыло, карболка (лизол), хлорамин и т. д.), горелка или спиртовка.

До начала эксперимента готовят и стерилизуют МПА. Разливают его стерильно в стерильные чашки Петри. Стерилизуют в автоклаве при 1,0 ати ватные палочки, уложенные в стеклянную или жестяную банку с крышкой. Перед постановкой опыта протирают поверхность рабочего стола раствором дезинфектанта. Чашки Петри с застывшим МПА раскладывают на столе, и дно каждой чашки делят на четыре сектора маркером, обозначив их цифрами от 1 до 4. Выбирают объекты исследования (дверная ручка, монета, указка, раковина, клавиатура компьютера и т. д.). На первой чашке пишут название объекта и № 1. Стерильным пинцетом у пламени горелки достают одну ватную палочку из контейнера, не касаясь рабочего кончика с ватой. Поверхность выбранного объекта протирают ватным кончиком палочки, периодически ее поворачивая. Открывают чашку Петри около пламени горелки и осторожно проводят ватным кончиком палочки по поверхности агара в секторе 1, не заходя за границы других секторов (рис. 18.6). Затем последовательно проводят палочкой по секторам 2—4, чтобы в 4-м секторе можно было ожидать появления отдельных колоний.

На второй чашке пишут название объекта и № 2. Протирают половину объекта бумажным полотенцем, слегка смоченным водой. Используя новую ватную палочку, ее рабочим концом берут пробу с вытертой области объекта. У огня открывают крышку чашки № 2 и делают последовательные посевы ватной палочкой в секторах 1—4. Третью чашку помечают № 3. Выбранным дезинфектантом протирают вторую половину объекта,.

Рис. 18.6. Рассев микроорганизмов с объекта на агар.

дают ему просохнуть и отбирают пробу новой ватной палочкой с продезинфицированной поверхности объекта. Производят посев рабочим концом палочки в чашку № 3, последовательно в 1—4 сектора. Все чашки ставят дном вверх на инкубацию в термостат при 30 °C на 2 сут. По окончании инкубации последовательно просматривают чашки и на каждый объект заполняют таблицу (табл. 18.10). Отмечают характер роста микроорганизмов в секторах (обильный или скудный, сплошной по штриху или в виде колоний, отсутствие роста).

Таблица 18.10

Рост микроорганизмов с изучаемого объекта на МПА.

Делают выводы о возможностях контроля микробной обсемененности объектов окружающей среды и об эффективности снижения уровня микробного загрязнения с помощью простой уборки или при использовании дезинфицирующих веществ.

Лабораторная работа 4.

Действие биоцидов на микроорганизмы.

Цель работы: данный эксперимент продемонстрирует студентам влияние разных концентраций антимикробных веществ на рост микроорганизмов. Они научатся определять минимальную эффективную концентрацию вещества, оказывающую бактерицидное действие.

В качестве модельного микроорганизма в опыте используется непатогенный штамм Е. coli К-12. Для работы следует выбрать концентраты таких известных биоцидов, как этанол, хлорамин, лизол, бытовой отбеливатель И Т.д.

Необходимые материалы (на 1 студента): пробирки с ватными пробками (количество зависит от начальной концентрации биоцида), чашки Петри (по числу сделанных разведений + контрольная), стерильный МПА в колбе, культура Е. coli на скошенном агаре в пробирке, стерильный МП Б в колбе, микробиологическая петля, пипетки на 1—2 мл, маркер, выбранный биоцид.

До начала эксперимента готовят пробирки с 4,5 мл водопроводной воды для десятичных разведений, МПБ и МПА в колбах и стерилизуют их в автоклаве при 1,0 ати. Стерилизуют сухие чистые чашки Петри и пипетки в сухо-жаровом шкафу. За сутки до начала опыта засевают МПБ с помощью петли культурой Е. coli со скошенного агара и ставят в термостат при 37 °C.

В день эксперимента готовят стерильно десятичные разведения выбранного биоцида в водопроводной воде, используя для каждого разведения новую стерильную пипетку. В одну пробирку (контроль) биоцид не вносят. В каждую пробирку, включая контрольную, вносят стерильно 0,1 мл культуры Е. coli и оставляют пробирки при комнатной температуре на 30 мин. Закрытые стерильные чашки Петри маркируют, указывая концентрацию биоцида в пробе. МПА в колбе расплавляют и остужают до 45 °C. По окончании инкубации содержимое пробирок перемешивают и вносят около пламени горелки 0,1 мл каждого разведения в соответствующую чашку Петри. Из колбы расплавленный и остуженный МПА разливают по чашкам (по 15—20 мл) с пробами разведений около пламени горелки, осуществляя глубинный посев. После застывания агара чашки крышками вниз помещают в термостат при 37 °C на 1—2 сут. (до появления видимых колоний).

После инкубации подсчитывают колонии в каждой чашке и определяют минимальную концентрацию биоцида, при которой рост бактерий отсутствует. Если использовали несколько биоцидов, то делают вывод о том, какой из них эффективнее угнетает микробный рост.

Лабораторная работа 5

Дезинфекция кожи спиртом

Цель работы: наглядно показать студентам эффективность такого простого способа дезинфекции кожи рук, как протирание их спиртом.

Микроорганизмы, живущие на коже человека, являются частью его нормальной микробиоты, препятствующей проникновению возбудителей заболеваний в организм через кожные покровы. Эти микроорганизмы присутствуют на коже всегда и не причиняют нам вреда. Однако иногда бывает необходимым удалить с кожи все микробные клетки, например, перед уколом лекарства или перед операцией. В этих случаях наиболее часто используется этанол как недорогой и нетоксичный дезинфектант. Он действует на большинство бактерий и грибов, разрушая липидные компоненты мембран и денатурируя белки, начиная с концентрации 33%, а максимальная его активность против микроорганизмов наблюдается при 70%.

Необходимые материалы (на 1 студента): чашка Петри со стерильным МПА, маркер, ватный диск или салфетка, 70% этанол в пузырьке.

С помощью маркера делят дно закрытой чашки Петри с МПА на четыре сектора, обозначив их цифрами от 1 до 4. Переворачивают чашку крышкой вверх (цифры должны отчетливо различаться через слой агара). Открывают чашку и касаются поверхности агара в середине сектора 1 подушечкой правого указательного пальца на 2 с. Затем сразу же касаются той же подушечкой агара в секторе 2. Палец удерживают 2 с. Потом подушечку левого указательного пальца помещают на 2 с на агар в секторе 3. Закрывают крышку чашки, смачивают ватный диск или салфетку спиртом и протирают подушечку левого указательного пальца в течение 10 с. После высыхания спирта на коже прикладывают обработанную подушечку пальца к агару в секторе 4 на 2 с. Чашку закрывают и помещают в термостат при 37 °C на 1—2 сут.

По окончании инкубации зарисовывают вид чашки и описывают характер роста микроорганизмов в каждом из четырех секторов. Подсчитывают и сравнивают количество колоний в секторах. Делают вывод об эффективности дезинфекции кожи спиртом.

Опыт можно усложнить, применяя для дезинфекции разные концентрации этанола (от 20 до 96% через 10—20% интервалы) или используя наряду со спиртом для обработки другие дезинфектанты (например, антибактериальное мыло). В этих случаях следует обсудить эффективность других способов дезинфекции по сравнению с протиранием смоченной спиртом, а также определить минимальную бактерицидную концентрацию этанола.

Семинар 3.

Множественная лекарственная устойчивость и способы ее преодоления Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных по ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Лабораторная работа 6.

Образование микроорганизмами антибиотиков.

Цели работы: эксперимент продемонстрирует способность некоторых микроорганизмов подавлять рост других бактерий, а также устойчивость некоторых микроорганизмов к антибиотикам.

Пенициллин и открытые вслед за ним другие антибиотики рассматривают как эффективное средство в борьбе со многими болезнями с высокой смертностью, приводящими к тяжелым эпидемиям среди людей. В этом эксперименте студенты будут использовать образующие антибиотики микроорганизмы из разных систематических групп (доменов). Это плесневый гриб Penicillium notatum, который продуцирует пенициллин, и мицелиальная актинобактерия Streptomyces griseus, синтезирующая стрептомицин. При росте на МПА в чашке Петри они образуют антибиотики, которые диффундируют в агар. Поэтому любые бактерии, чувствительные к этим антибиотикам, нс будут расти вблизи микроорганизмов-продудентов.

Необходимые материалы (на 1 студента): термостат на 37 °C, культуры Escherichia coli, Penicillium notatum, Streptomyces griseus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus на скошенном агаре в пробирках, микробиологическая петля, газовая горелка или спиртовка, МПА (600—700 мл) в колбе, 3 стерильные чашки Петри, 3 пробирки с 5 мл водопроводной воды в каждой, маркер.

За 3—5 сут. перед началом эксперимента заворачивают и стерилизуют «сухим жаром» сухие чистые чашки Петри. Готовят и стерилизуют в автоклаве при 1,0 ати МПА в колбе и водопроводную воду в пробирках по 5 мл. Расплавленный и остуженный до 45—50°С стерильный МПА разливают у пламени горелки в стерильные чашки Петри по 20—25 мл. После застывания агара чашки переворачивают вверх дном, чтобы конденсат оказался на крышке. Культуры продуцентов антибиотиков Penicillium notatum и Streptomyces griseus засевают каждую в отдельную чашку с МПА. Засеянные чашки инкубируют вверх дном при комнатной температуре.

Перед началом опыта закрытые чашки Петри с МПА маркируют, обозначив на дне с краю чашки один из продуцентов или контрольный вариант и линии, по которым будут подсеваться продуцент и тест-культуры (рис. 18.7).

Рис. 18.7. Схема посева продуцента антибиотика и тест-культур:

П — пеницилл; С — стрептомицет; К — контроль; М — микрококк; Б — бацилла;

Э — эшерихия У пламени горелки проводят посев культур-продуцентов в опытные чашки в соответствии с маркировкой. Петлей дотрагиваются до газона продуцента в ранее засеянных чашках и проводят штрих по соответствующей линии в стерильной чашке с МПА. На контрольную чашку посев не производят. Засеянные и контрольную чашки помещают на инкубацию в течение 4—7 сут. при 30 °C.

За сутки до окончания инкубации тест-культуры пересевают со скошенного агара на МПА в чашках Петри и выдерживают при температуре 37 °C в течение 18—24 ч. Затем готовят суспензии бактериальных тест-культур в стерильной водопроводной воде в пробирках. Для этого у пламени горелки петлей отбирают клетки с агара в чашке и переносят в воду в подписанной пробирке, растирая биомассу о стенку пробирки и тщательно перемешивая содержимое. К выросшим в опытных чашках штрихам продуцентов подсевают петлей суспензии бактериальных тест-культур, открывая крышку чашки у пламени горелки и ведя штрих каждой тест-культуры по обозначенной для нее линии от края чашки к штриху выросшего продуцента. После посева каждой тест-культуры следует прожигать и остужать петлю. В контрольной стерильной чашке проводят три штриха из суспензий тест-культур, перпендикулярно к линии К. Засеянные чашки инкубируют вверх дном при 30 °C в течение 1—3 сут.

По окончании инкубации описывают и зарисовывают картины роста тест-культур и продуцента в опытных и контрольной чашках. Делают выводы о том, какие тест-культуры и в какой степени чувствительны, а какие устойчивы к данным антибиотикам.