Изучение численности отдельных физиологических групп почвенных микроорганизмов в зависимости от антропогенной нагрузки

— 18 ;

Оглавление Введение

1. Обзор исследовательской литературы

1.1 Почва как среда обитания микроорганизмов

1.2 Некоторые физиологические группы почвенных бактерий

1.3 Значение микроорганизмов почвы

2. Материалы и методы эмпирического исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Количественный учет

2.2.1 Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

2.2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

2.2.3 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского — Брида)

2.3 Среды и условия культивирования

3. Результаты и их обсуждение Заключение Список использованной литературы Приложение

Введение

Почва является важнейшим компонентом любого биогеоценоза, а, следовательно, и биосферы в целом. Плодородие почвы в значительной мере определяет продуктивность природных ценозов и агроценозов и, в свою очередь, зависит от жизнедеятельности населяющих ее микроорганизмов. Изменения, происходящие в микробоценозах почв, в связи с различным использованием человеком земель являются объективными показателями качества почв. Для человечества важной является задача сохранения плодородия почв, поэтому необходимо продолжать изучать и устанавливать определенные микробиологические критерии, позволяющие оценить антропогенную нагрузку на почву.

Цель работы: изучение динамики численности отдельных физиологических групп почвенных микроорганизмов в зависимости от антропогенной нагрузки на примере серой лесной почвы и чернозема выщелоченного.

Для достижения данной цели решали следующие задачи:

1) определить общую численность бактерий в образцах серой лесной почвы и чернозема выщелоченного;

2) определить численность основных физиологических групп аэробных и анаэробных бактерий (сапротрофы, азотфиксаторы, маслянокислые бактерии, сульфати железоредукторы) в почвенных образцах;

3) определить соотношение аэробных и анаэробных бактерий;

4) выявить основные закономерности динамики численности бактерий в связи с интенсификацией сельскохозяйственного использования почвы;

5) установить особенности динамики численности исследованных групп бактерий в зависимости от типа почвы.

1. Обзор исследовательской литератур

1.1 Почва как среда обитания микроорганизмов Для микроорганизмов почва выступает как сложная гетерогенная система микросред с резко различающимися условиями обитания в каждом отдельном микролокусе. Так, микроорганизмы, обитающие на поверхности почвенных агрегатов и внутри них, развиваются в совершенно разных условиях по доступности питательных веществ, кислорода, влажности, температуры, рН и др. В результате этого, почва содержит огромное количество и биоразнообразие микроорганизмов, которые и обуславливают протекание ряда почвообразовательных процессов. Кроме того, микроорганизмы являются необходимым звеном в круговороте всех биогенных элементов, участвующих в почвообразовании и в поддержании почвенного плодородия. По мнению Д. Г. Звягинцева [8], до сих пор из почвы удалось выделить далеко не все обитающие в них микроорганизмы, нет четких представлений о специфике развития микробов в почвах, трудно описать кинетику вызываемых ими процессов. Численность микроорганизмов измеряется величинами порядка 10⁶ — 10⁹ кл/г почвы.

Состав и количество микроорганизмов почвы зависит от многих факторов: влажности, температуры, от характера и количества питательных веществ, кислотности и др. Плодородные почвы с большим количеством органических веществ содержат значительно большее число микроорганизмов, чем глинистые почвы или почвы пустынь. Распределение микробов в почве также неравномерно. Верхний слой (1,0−2,0 см) содержит меньше микроорганизмов, так как они быстро отмирают под действием прямых солнечных лучей и высушивания. Слой, глубиной 10,0−20,0 см, наиболее заселен разнообразными микроорганизмами, под влиянием которых в нем протекают различные биохимические процессы. С глубиной количество микробов постепенно снижается в связи с уменьшением питательных веществ, концентрации кислорода, изменением рН и окислительно-восстановительных условий и в связи с этим, изменяется доступность для микроорганизмов ряда биогенных элементов.

Микрофлора почвы чрезвычайно разнообразна в видовом отношении. В ней встречаются различные физиологические группы микроорганизмов: сапротрофные, олиготрофные, нитрифицирующие, азотфиксирующие, денитрифицирующие, целлюлозоразрушающие, бродильные, сульфат — и железовосстанавливающие бактерии и др. Среди них могут быть аэробные и анаэробные микроорганизмы, спорообразующие и неспорообразующие, пигментированные и непигментированные, гигрофильные и ксерофильные и т. д. Кроме того, в почве содержатся разнообразные грибы, простейшие, водоросли, вирусы.

1.2 Некоторые физиологические группы почвенных бактерий Сапротрофные аэробные и анаэробные бактерии Сапротрофные бактерии (гр. sapros — гнилой; throphe — пища) осуществляют процесс минерализации органических веществ различного происхождения в аэробных и в анаэробных условиях. К этому причастны гетеротрофные прокариоты различных таксономических и физиологических групп. Минерализация органических соединений в аэробных и микроаэробных условиях при участии аэробных и факультативно анаэробных гетеротрофных бактерий происходит с образованием, главным образом, низкомолекулярных соединений — СО₂, Н₂О, NH₃, H₂S и др. Анаэробная биодеградация органических соединений происходит в три-четыре последовательных этапа. Начальной стадией разрушения органических веществ является их гидролиз до простых соединений (аминокислоты, моносахара, глицерол, жирные кислоты и т. д.). К анаэробным бактериям, осуществляющим этот процесс в природе, относятся, например, некоторые представители рода Clostridium. На втором этапе действуют микроорганизмы, сбраживающие образованные на первой стадии органические вещества в анаэробных условиях с образованием, главным образом, летучих жирных кислот (уксусная, молочная, пропионовая, масляная, янтарная и др. кислоты) и Н₂. К бактериям, осуществляющим процесс брожения, относятся, например, уксуснокислые, молочнокислые, маслянокислые, пропионовокислые бактерии. На последней стадии анаэробного разложения органического вещества продукты брожения при участии высокоспециализированных групп метанобразующих и сульфатвосстанавливающих бактерий расходуются с образованием CH₄ и H₂S, соответственно.

Азотфиксирующие бактерии Азотфиксирующие бактерии (азотфиксаторы), усваивают молекулярный азот атмосферы (N₂). В процессе азотфиксации N₂ восстанавливается до NН₄⁺, который реагирует с кетокислотами, образуя аминокислоты. Азотфиксаторы живут либо свободно в почве (свободно живущие или ассоциативные азотфиксаторы), либо в симбиозе с высшими растениями (симбиотические азотфиксаторы). Ежегодно азотфиксирующие бактерии вовлекают в азотный фонд почвы нашей планеты до 190 млн. т азота.

Железовосстанавливающие бактерии Бактерии данной физиологической группы при окислении различных органических соединений (углеводов, органических кислот, спиртов, гумусовых соединений почвы и др.) осуществляют восстановление Fe (III) до Fe (II). Железоредукция может носить ассимиляционный и диссимиляционный характер. В первом случае восстановление железа является результатом взаимодействия Fe (III) с восстановленными продуктами метаболизма, во втором — процессом, который дает энергию для процессов жизнедеятельности.

Сульфатвосстанавливающие бактерии Микроорганизмы восстанавливают сульфат для двух целей. Во-первых, подобно большинству растений, многие бактерии способны извлекать из данного процесса серу для синтеза серосодержащих клеточных компонентов (ассимиляционная сульфатредукция). Во-вторых, прокариоты способны осуществлять диссимиляционную сульфатредукцию (или сульфатное дыхание), при этом сульфат в анаэробных условиях служит конечным акцептором электронов при окислении различных органических веществ (сахаров, спиртов, органических кислот, аминокислот и пр.), в результате образуется токсичный H₂S.

Маслянокислые бактерии Возбудители маслянокислого брожения — строгие анаэробы, широко распространены в почве (как правило, содержатся в 90% почвенных образцов), навозе, загрязненных водоемах, в разлагающихся растительных остатках, молоке, на поверхности растений. В процессе масляннокислого брожения углеводы сбраживаются бактериями до масляной кислоты, могут образовываться также уксусная кислота, бутиловый спирт и ацетон.

1.3 Значение микроорганизмов почвы Благодаря жизнедеятельности почвенных микробов, большинство которых являются редуцентами, происходит разложение и минерализация животного и растительного опада с образованием гумусовых веществ, процесс самоочищения почвы от ксенобиотиков, попадающих в нее в результате хозяйственной деятельности человека (пестициды, нефтепродукты, нитроароматические вещества, пластмассы, полиэтилен и т. д.). С помощью микроорганизмов почвы осуществляется биологический круговорот многих минеральных элементов (углерод, кислород, сера, азот, фосфор, железо и марганец).

Микробы поддерживают на определенном уровне состав азота в почве. Из-за неравномерных потерь (вымывание водой, улетучивание в атмосферу) содержание азота в почве сильно уменьшилось бы, если бы микробы постоянно не возвращали молекулярный атмосферный азот в почву в результате процесса азотфиксации.

Микроорганизмы участвуют также в изменениях структуры и химического состава органической фракции почвы. Так, все процессы образования новых веществ и биологической минерализации идут благодаря длинной цепи последовательных и тесно переплетающимися между собой реакций, осуществляемых микроорганизмами. При этом минеральные элементы могут переходить из окисленного состояния в восстановленное, и обратно. Часть веществ вовлекается в состав резервных веществ почвы — гумусовых кислот.

Обычно биологические реакции обратимы. Как правило, они образуют цепи повторяющихся биологических процессов. Соотношения между разными физиологическими группами микроорганизмов в разных типах почв и в зависимости от антропогенной нагрузки неодинаковы и могут быстро изменяться под действием тех или иных факторов, что может служить диагностикой состояния почвы. В результате антропогенной нагрузки на почвы в связи с их хозяйственным использованием меняются условия обитания микроорганизмов, а, следовательно, изменяется соотношение основных физиологических групп микроорганизмов.

2. Материалы и методы эмпирического исследования

2.1 Объект исследования Объектом исследования служили 6 почвенных образцов с различной антропогенной нагрузкой, 3 из которых относятся к серой лесной легкосуглинистой почве (Брянская обл.):

1) S101 — целина, растительность: клевер и злаки (контроль);

2) S102 — залежь, растительность: люпин (слабая антропогенная нагрузка;

3) S103 — интенсивное земледелие, кукуруза (значительная антропогенная нагрузка), и 3 образца чернозема выщелоченного (Тамбовская область);

4) S42 — целина, растительность: клевер и злаки (контроль);

5) S44 — залежь, разнотравье (слабая антропогенная нагрузка);

6) S41 — интенсивное земледелие, пшеница (значительная антропогенная нагрузка).

Некоторые физико-химические параметры исследуемы почвенных образцов показаны в табл. 1.

Таблица 1.

Некоторые физико-химические параметры почвенных образцов

2.2 Количественный учет

2.2.1 Определение количества клеток высевом на плотные питательные (метод Коха)

Этот метод позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Определение числа клеток микроорганизмов включает три этапа.

1. Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. В начале было приготовлено разведение в 100 раз (10^-2), для этого подвешивали 1 г почвы на часовом стекле и переносили в колбу со 100 мл 0,85% NaCl и гомогенизировали (гомогенизатор Gomogenizer type — 302, Польша) 5 мин при 400 об/мин. Затем из гомогенизированного раствора отбирали 1 мл жидкости и переносили в пробирку с 9 мл стерильного 0,85% NaCl, это разведение уже в 1000 раз (10^-3). Таким же образом были приготовлены и последующие разведения до 10^-10.

2. Посев. С полученных разведений исследуемых образцов производится посев глубинным способом. При глубинном посеве точно измеренный объём (1,0 мл) разведения вносят стерильной пипеткой в 2−4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15−20 мл расплавленной и остуженной до 48 — 50С питательной средой. Когда среда застывает, чашки Петри в перевернутом виде заворачивают в бумагу и помещают в термостат (28С).

3. Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2 — 15 суток инкубации. Подсчет проводят не открывая чашек Петри.

Чашечный метод Коха использовали для подсчета численности сапротрофов и азотфиксаторов.

2.2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды

1. Приготовление разведений (см. п. 3.2.1.).

2. Посев в жидкую среду и регистрация результатов. Среду предварительно разливают в пробирки и стерилизуют. Посев производят из тех же разведений, что и в чашечном методе, т. е. с 10^-3 до 10^-10. На каждое разведение готовилось две параллельные пробирки. Количество посевного материала везде одинаково и составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется 7- 28 сут. Наиболее вероятное количество клеток в единице объёма рассчитывают по таблице Мак-Креди [13], разработанной на основании методов вариационной статистики. Метод предельных разведений использовали для подсчета численности бродильных бактерий, сульфати железоредукторов.

2.2.3 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида) Метод широко используется для определения численности микроорганизмов в различных естественных субстратах — почве, загрязненных водах, молоке и т. п. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 1 см². Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объем исследуемой суспензии (в нашем случае — почвенная суспензия в разведении 10^-3). Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей на отмеченном 1 см², препарат подсушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают. Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата, вычисляют по формуле:

М= (aS/sV)n,

где М — количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата, а — среднее число клеток в квадрате окулярной сетки, s — площадь квадрата окулярной сетки (мкм²), V — объем нанесенной на стекло суспензии в мл, S — площадь приготовленного мазка (мкм²), n — разведение исследуемого субстрата. Метод Виноградского-Брида использовали для подсчета общей численности бактерий в почве[4].

2.2 Среды и условия культивирования Для подсчета численности сапротрофов использовали среду РПА, анаэробов — МПБ, азотфиксаторов — безазотную среду Эшби, сульфатредукторов — среду Баарса, железоредукторов — среду Лавли; маслянокислыех — МПБ с добавлением 3−5% глюкозы. Культивирование микроорганизмов осуществлялось в термостате при температуре + 28⁰ С.

3. Результаты и их обсуждение В процессе работы с образцами серых лесных легкосуглинистых почв (S101, S102 и S103) и чернозема выщелоченного (S41, S42, и S44) нами были получены данные по общей численности бактерий и по численности некоторых физиологических групп бактерий, результаты представлены в табл. 2. и в Приложении 1.

Таблица 2

Данные по общей численности и численности исследованных физиологических групп в почвенных образцах серой лесной легкосуглинистой почвы и чернозема выщелоченного

Как видно из таблицы 2, общая численность бактерий в почвенных образцах зависит от типа почвы и от антропогенного воздействия на почву. Так, этот показатель на два порядка выше (n? 10¹⁰) в черноземе по сравнению с серой лесной легкосуглинистой почвой (n? 10⁸).

Объясняется этот факт гораздо большим содержанием органического вещества (гумуса) в черноземе, чем в серой лесной почве (табл. 1). Тем не менее, для обоих типов почв характерно снижение общей численности бактерий в связи с нарастанием антропогенной нагрузки. Вероятно, это обусловлено, тем, что при распашке почвы нарушаются «естественные» экологические ниши почвенных микроорганизмов, нарушаются трофические цепи в микробоценозе, что приводит к общему снижению численности почвенного населения.

В 2 раза снижается численность аэробных сапротрофных бактерий в образцах серой лесной почвы и более, чем в 4 раза — в черноземе выщелоченном. По-видимому, это объясняется общей тенденцией снижения численности микроорганизмов в связи с антропогенной нагрузкой. Численность сапротрофов в черноземе выщелоченном на 1−2 порядка больше, чем в серой лесной почве.

Численность анаэробных бактерий так же снижается с увеличением антропогенной нагрузки. Причем, это наиболее заметно в черноземе выщелоченном: в контрольном варианте (S42) численность анаэробов примерно в 4,5 раза выше по сравнению с образцом S41 (интенсивное земледелие).

Очевидно, аэрирование почвы при вспашке, периодическое рыхление (агротехнические мероприятия) снижают численность анаэробов. Этим же объясняется снижение численности других анаэробов железовосстанавливающих и маслянокислых бактерий. Кроме того, валовое количество железа (табл. 1) снижается в ряду: контроль залежь интенсивное земледелие. Это является еще одним фактором, ограничивающим жизнедеятельность железоредукторов. В образцах серой лесной легкосуглинистой почвы практически не меняется численность азотфиксирующих бактерий.

Иная картина наблюдается в образцах почвы чернозема выщелоченного: минимальное количество азотфиксаторов наблюдается в залежи (S44). Очевидно, это связано с нарушением природного микробоценоза в результате однократного антропогенного вмешательства. Однако, численность азотфиксаторов в образцах почвы с интенсивной сельскохозяйственной нагрузкой не намного меньше, чем в контроле. По-видимому, этот факт можно объяснить преимущественным развитием ассоциативной азотфиксирующей микрофлоры с корнями пшеницы.

Численность сульфатредукторов в на три порядка выше в черноземе выщелоченном. Этот микробиологический показатель не меняется в образцах серой лесной почвы (10⁰). Такая низкая численность сульфатвосстанавливающих бактерии, по-видимому, обусловлена низким содержанием сульфатов. Интересным является факт резкого увеличения численности сульфатредукторов (на 2 порядка) в образце чернозема выщелоченного S44 (залежь). Такое значительное развитие бактерий данной физиологической группы свидетельствует о нарушении аэробно-анаэробного равновесия почвенного микробоценоза в анаэробную сторону. Образующийся в процессе сульфатредукции токсичный H₂S скорее всего станет причиной почвоутомления.

На основании результатов проделанной работы можно сделать следующие выводы.

Заключение

Общая численность бактерий в почвенных образцах зависит от типа почвы. Общая численность бактерий на два порядка выше в черноземе по сравнению с серой лесной легкосуглинистой почвой, поскольку в черноземе содержание гумуса в 2−3 раза выше, чем в серой лесной почве.

Общая численность бактерий в почвенных образцах снижается от интенсивности антропогенного воздействия на почву. Вероятно, при распашке почвы нарушаются «естественные» экологические ниши почвенных микроорганизмов, нарушаются трофические цепи в микробоценозе, что приводит к общему снижению численности почвенного населения.

Численность исследованных физиологических групп бактерий снижается с в ряду контрольная почва (целина) залеж интенсивное земледелие и в нашем случае наиболее заметно снижается в черноземе выщелоченном.

Агротехнические мероприятия приводят к смещению микробоценоза серой лесной легкосуглинистой почвы и чернозема выщелоченного в аэробную сторону, т.к. численность анаэробных бактерий снижается с увеличением антропогенной нагрузки. Причем, это наиболее заметно для чернозема выщелоченного.

Фактором, ограничивающим размножение железовосстанавливающих бактерий в почвах является снижение валового количества железа в ряду: контроль залежь интенсивное земледелие.

Численность азотфиксаторов в образцах почвы с интенсивной сельскохозяйственной нагрузкой сопоставимо с контрольными образцами, что можно объяснить преимущественным развитием ассоциативной азотфиксирующей микрофлоры с корнями возделываемых сельскохозяйственных культур.

Численность сульфатредукторов не превышает 10⁰ во всех почвенных образцах серой лесной легкосуглинистой почвы, что это связано с низкой концентрацией сульфатов.

Численность сульфатредукторов выше на три порядка в черноземе выщелоченном, по-видимому за счет более высокого содержания гумусовых веществ и преимущественного развития ассимиляционной сульфатредукции.

Однократное использование чернозема выщелоченного (залежь) привело к резкому увеличения численности сульфатредукторов, что свидетельствует о нарушении аэробно-анаэробного равновесия почвенного микробоценоза. Образующийся в процессе сульфатредукции токсичный H₂S скорее всего станет причиной почвоутомления.

1. Аристовская Т. В. Микробиология процессов почвообразования. Л., Наука, 1980.

2. Бакулина Н. А., Краева Э. Л. Микробиология. М., Медицина, 1980.

3. Бершова О. И. Микроэлементы и почвенные микроорганизмы. Киев, Наукова Думка, 1967.

4. Верховцева Н. В., Рыжикова И. А. Экология микроорганизмов: лабораторные занятия для студентов экологов (бакалавров). Ярославль: Издательство ЯрГУ, 2001

5. Гиляров М., Криволуцкий Д. Жизнь в почве. М., Молодая гвардия, 1985.

6. Добровольский В. В. География почв с основами почвоведения. М., Владос, 2001.

7. Емцев В. Т., Емцев М. Т. Мир почвенных микробов. М., Колос, 1966.

8. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы М., Издательство московского университета, 1987.

9. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина, 1978

10. Никитин Д. И. Новые и редкие формы почвенных микроорганизмов. М., Наука, 1966.

11. Филина Н. Ю., Верховцева Н. В. Экологическая физиология микроорганизмов. Часть первая Физиология микроорганизмов. Ярославль: Издательство ЯрГУ, 2001

12. Шлегель Г. Общая микробиология, М., Мир 1989.

13. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Н. С. Егорова. М.: Изд-во МГУ. 1995.

Приложение Диаграммы

— 18 ;

— 18 ;