Фиксация молекулярного азота атмосферы

В воздухе содержится 78,09% азота в виде N₂, который вместе с С0₂ и u₂ через устьица попадает в лист. Исследователей давно интересовал вопрос, могут ли высшие растения его усваивать. На этот вопрос в 40-е гг. XIX в. после многочисленных опытов отрицательно ответил II. Т. Соссюр (Швейцария). Однако даже в XX в. дискуссия возобновлялась несколько раз.

В 1886—1888 гг. Г. Гельригель и Г. Вильфарт (Германия) экспериментально доказали, что использовать азот воздуха для питания могут бобовые растения при помощи специальных бактерий, живущих в клубеньках. В настоящее время точно известно, что только прокариоты (бактерии и большинство цианобактерий) способны фиксировать атмосферный азот благодаря присутствию фермента нитрогеназы.

Микроорганизмы, осуществляющие биологическую фиксацию азота, делят на две группы — свободиоживущие в почве и живущие в симбиозе с высшими растениями. Последние образуют клубеньки на корнях растений. У некоторых тропических деревьев и кустарников клубеньки развиваются у основания листовых черешков.

К группе симбиотических азотфиксаторов относят, прежде всего, бактерии рода Rhizobium, Brady rhizobium, Azorhizobium, а также большинство цианобактерий (Nostoc, ЛпаЬепа) и некоторые актиномицеты (Frankia). Бактерии-азотфиксаторы получили общее название ризобий.

Симбиоз с азотфиксирующими клубеньковыми бактериями прежде всего был обнаружен у бобовых растений (белая и желтая акация, горох, фасоль, соя, чечевица, клевер, люпин и другие пищевые и кормовые растения). В настоящее время насчитывают около 190 видов растений девяти семейств, способных симбиотически усваивать азот. К их числу относятся облепиха, ольха, лох и др. Кроме цветковых растений, участвуют в симбиозе некоторые сосновые, папоротниковидные и лишайники. Некоторые лишайники, представляющие собой симбиоз гриба и азотфиксирующих цианобактерий, растут на скалах в горах и других бесплодных местах, являясь пионерами заселения суши.

Клубеньковые бактерии широко распространены в почве. При недостатке азота корень выделяет флавоноиды, привлекающие бактерии (см. параграф 1.3). Благодаря хемотаксису бактерии перемещаются к поверхности корня и прикрепляются к кончику молодого корневого волоска. Хемотаксис (от лат. chimia — химия и греч. taxis — расположение в порядке) — движение организмов, преимущественно одноклеточных, и клеток под влиянием химических раздражителей.

Корневой волосок захватывает бактерии и образует инфекционную нить (см. гл. 10), в которой размножаются бактерии. Нить проникает в первичную кору корня и вызывает интенсивное деление инфицированных клеток, что приводит к образованию клубенька. При этом сами бактерии включаются в цитоплазму растительной клетки, очень быстро размножаются превращаются в бактероиды. У бактероидов исчезает клеточная стенка, теряется форма, характерная для свободноживущих бактерий. Бактероиды в среднем в 40 раз больше по объему, чем исходная бактерия. Бактероиды окружаются перибактероидной мембраной, формируемой растением. Сами бактерии прекращают делиться, и начинается фиксация азота.

На этой мембране находится дыхательная цепь, комплексы которой соответствуют основным комплексам митохондриальной дыхательной цепи растительных клеток. Мембрана бактероида непроницаема для кислорода. Кислород, диффундирующий в клубеньки вместе с азотом из воздуха, расходуется в дыхательной цепи, поэтому внутри клубенька создаются анаэробные условия.

Молекулярный азот фиксируют только те клубеньки, в которых есть специальный белок леггемоглобин (легглобин). Его название показывает, что впервые он был обнаружен у бобовых растений, представителей рода Leguminosae. Это белок розового цвета, родственный гемоглобину крови и связывающий, как и гемоглобин, кислород. Он синтезируется в клетках растения-хозяина, встраивается в мембрану бактероида и обеспечивает транспорт кислорода к дыхательной цепи бактероида и образование АТФ. Леггемоглобин может составлять до 25% общего количества растворимых белков клубенька и придает им розовый цвет. Появление этого белка совпадает по времени с началом фиксации азота, а его разрушение — с ее прекращением.

Корневой клубенек окружен разветвленным проводящим пучком, который соединяется с проводящими тканями центрального цилиндра корня. Следовательно, между клубеньками и растением-хозяином существует система транспорта для обмена питательными веществами. Растение обеспечивает азотфиксирующие бактерии метаболитами, а бактерии снабжают растения органическим азотом, поэтому эти растения способны выживать без азотных удобрений.

Азотфиксация — это восстановительный процесс, первым стабильным продуктом которого является аммиак. Процесс азотфиксации протекает в бактероиде, его молекулярный механизм в последние годы изучен достаточно хорошо. По-видимому, он одинаков для всех азотфиксирующих ми кроорган измов.

Суммарное уравнение азотфиксации таково:

В процессе азотфиксации на одну молекулу восстановленного азота образуется по меньшей мере одна молекула водорода:

Главный фермент — нитрогеназа, состоящая из двух компонентов: более высокомолекулярного белка, содержащего молибден и железо, и низкомолекулярного белка, содержащего железо и серу. Высокомолекулярный Мо-Ге-белок нитрогеназы (молекулярная масса 200—250 кДа) содержит 2 атома Мо, 28—34 атома Ре и 18—24 атома Б на молекулу. Низкомолекулярный белок нитрогеназы (молекулярная масса 50—70 кДа) содержит по 4 атома Ее и Б на молекулу фермента. Возникновение бактероидов тесно связано с образованием нитрогеназной ферментативной системы.

Субстрат (Ы₂) связывается и восстанавливается на высокомолекулярном компоненте фермента, а его низкомолекулярный компонент служит источником электронов для восстановления высокомолекулярного компонента, которые он получает от ферредоксина. Комплекс двух компонентов нитрогеназы существует лишь во время сопряженного с гидролизом АТФпереноса электронов от Ре-белка к Мо-Ре-белку.

Нитрогеназа катализирует три типа реакций: 1) восстановление субстрата; 2) зависимый от восстановителя гидролиз АТФ и 3) АТФ-зависимое выделение Н₂. Почему при азотфиксации выделяется водород, пока неизвестно. У некоторых бактероидов имеются гидрогеназы, которые повторно окисляют водород с образованием воды.

Для этого процесса необходим постоянный приток электронов и энергии в форме АТФ: 30—40 молей АТФ на 1 моль фиксированного N3. Источником электронов и АТФ для функционирования нитрогеназы служат ассимиляты, синтезирующиеся в клетках листьев растения-хозяина и поступающие в корневые волоски. Расход ассимилятов у бобовых па 1 г фиксированного И₂ составляет в среднем 6,5—7 г углерода, а у свободноживущего азотобактера — 28—40 г. Следовательно, эффективность использования энергетических субстратов у симбиотических ризобий значительно выше (10—15%), чем у свободноживущих (1,5—2%).

Основной ассимилят, которым растение снабжает бактероиды, — манат, образуемый из сахарозы. Сахароза транспортируется в клубенек по флоэме и сначала гидролизуется, а затем в гликолизе превращается в ФЕП, который карбоксилируется с участием ФЕП-карбоксилазы с образованием оксалоацетата, последний восстанавливается в малат. В клетках клубеньков ФЕП-карбоксилаза содержится в большой концентрации и очень активна.

Малат, поступающий в бактероиды, может окисляться в цикле Кребса. Часть образуемых восстановленных коферментов НАДН и ФАДН₂ используется в дыхательной цепи бактероида для образования АТФ. Другая часть НАДН служит для восстановления ферредоксина и поставляет электроны для нитрогеназного комплекса.

Функционирующий в бактероиде цикл Кребса:

• 1) является источником субстратов для окисления в ЭТЦ, осуществляющей синтез АТФ;
• 2) обеспечивает нитрогеназу электронами;

3) поставляет оксокислоты, например кетоглутарат, которые, реагируя с аммиаком, образуют АМК, транспортируемые затем в клетки растенияхозяина.

Итак, для формирования клубенька необходимы леггемоглобин, ферменты, разлагающие углеводы и, прежде всего, сахарозу, ферменты цикла Кребса и синтеза глутамина и аспарагина, а также аквапорины, располагающиеся в перибактероидной мембране. Эти белки синтезируются растением-хозяином в ходе формирования клубенька и называются иодулипалш.

Клубеньки фиксируют азот 4—6 недель, затем они отмирают. Из отмерших клеток освобождаются бактерии в количестве большем, чем их поступило в корневой волосок, и они продолжают размножаться в почве около поверхности корня растения-хозяина.

ЫН₄ как продукт азотфиксации транспортируется из бактероида в клетку хозяина, где он превращается главным образом в глутамин и аспарагин, а далее транспортируется по сосудам ксилемы в другие органы растения. Бактероиды не могут синтезировать глутаминсинтетазу и с ее помощью переводить аммиак в глутамин (см. подпараграф 6.4.2). Бактерии получают аминокислоты для собственного синтеза белков из клеток растения-хозяина. Из клеток корневого клубенька излишек восстановленного азота транспортируется по ксилеме в форме глутамина и аспарагина.

Транспорт веществ из корневого клубенька в растение и из растения в клубенек происходит через проводящий пучок, который заложен, но периферии клубенька.

Нитрогеназа разрушается в присутствии кислорода, поэтому азотфиксация может идти только при очень низких концентрациях кислорода, а клубеньки — анаэробный компартмент.

Для защиты нитрогеназы от кислорода существует ряд механизмов. У ризобиума эту функцию выполняет леггемоглобин. Имеющийся в высокой концентрации в цитозоле хозяйских клеток леггемоглобин эффективно связывает кислород и понижает тем самым концентрацию свободного кислорода настолько, что нитрогеназа не повреждается. У цианобактерий (например, у Ао.^ос) образуются специальные гетероцисты, в которых происходит фиксация азота. Фиксация С0₂ в них подавлена. Бактериальная дыхательная цепь находится в мембране бактероида, а нитрогеназа — внутри бактероида, поэтому внешний слой клубенька является диффузионным барьером для проникновения кислорода.

На фиксацию молекулярного азота атмосферы влияют интенсивность фотосинтеза как источника растворимых углеводов, интенсивность дыхания (у клубеньков она выше, чем у корней), свет (при затенении число клубеньков снижается). Стимулируют фиксацию азота калий, фосфор, но только в небольших дозах, в больших — они ее подавляют. Необходим также молибден. Например, ольха на бедных молибденом почвах образует маленькие клубеньки и испытывает азотное голодание. Клубеньки образуются лишь при дефиците азота в почве, избыток аммонийных солей и нитратов в почве подавляет фиксацию атмосферного азота. Бобовые и другие растения, образующие симбиоз с ризобиями, могут выживать на почвах, очень бедных азотом, на которых другие растения погибают, однако для получения урожая их нужно дополнительно снабжать азотными удобрениями, хотя и в меньших количествах.

Симбиоз бобовых растений с клубеньковыми бактериями (ризобиями) широко распространен и очень важен для сельского хозяйства. В странах с умеренным климатом возделывание бобовых может обеспечивать фиксацию в среднем до 55—140 кг азота на га в год; свободноживущие азотфиксаторы — только 15—20 кг. На то, что бобовые растения обогащают почву азотом, впервые обратил внимание Ж. П. Буссенго (Франция, 1836). Симбиоз водного папоротника ЛгЫа с цианобактерией №Ыос снабжает азотом рисовые поля. Деревья обогащают почву азотом только в результате листопада, выделение азотистых веществ отмирающими корнями и клубеньками незначительно. Роща молодой ольхи дает за семь лет прирост азота 700 кг на га.