Физиологические и молекулярные механизмы адаптации к отрицательным температурам

Не имея эволюционно сформированных анатомических приспособлений для защиты от действия отрицательных температур, растения повышают свою морозоустойчивость, адаптируясь на физиологическом, биохимическом и молекулярном уровнях. Механизмы устойчивости к действию отрицательных температур отсутствуют в оптимальных условиях роста и образуются лишь в ответ на действие стрессорного фактора. Рассмотрим их подробнее.

1. Накопление сахаров и других совместимых осмолитов, прежде всего пролина, обладающих осморегуляторным и стресс-протекторным действием (от лат. protector — покровитель, защитник).

Еще Г. Мюллером-Тургау было замечено (1882), что в зимнее время в листьях растений, находящихся под снегом, нельзя обнаружить крахмал, но в них накапливается много сахарозы. При низкой температуре крахмал превращается в сахарозу, при потеплении происходит обратное превращение. Это превращение идет в клетках коры зимующих деревьев (дуба, клена, рябины), клубней и корневищ. Сахара накапливаются в клеточном соке, органеллах, особенно в хлоропластах. Чем выше концентрация раствора, тем ниже точка его замерзания, поэтому при накоплении сахаров уменьшается количество образующегося льда. Дж. Левитт показал, что листья капусты, обработанные раствором сахаров или глицерином, повреждались меньше при температуре -30°С по сравнению с необработанными листьями. Взаимодействуя с белками мембран, сахара стабилизируют их структуру, и прежде всего структуру хлоропластов. Когда сахаров много, фотофосфорилирование идет даже при отрицательных температурах. Хорошими протекторами для мембран хлоропластов при их промораживании в течение 3—4 ч при -25°С являются не только сахароза, но и раффиноза, а также янтарная и лимонная кислоты.

Сахара также препятствуют образованию или уменьшают количество токсических веществ, образующихся при обезвоживании клеток из-за образования льда. Сахара — главный дыхательный субстрат, являющийся источником энергии для синтезов, происходящих в период закаливания при низких положительных температурах.

Помимо сахарозы, в растениях наблюдается активный синтез и ряда других совместимых осмолитов. Среди этих соединений особая роль принадлежит пролину и некоторым другим аминокислотам. Пролин и сахароза защищают белки от инактивации в условиях обезвоживания, понижают водный потенциал клетки и тем самым препятствуют ее интенсивной дегидратации, снижают температуру замерзания содержимого протопласта, защищают макромолекулы и мембраны от разрушительного воздействия активных форм кислорода, а также являются эффективными энергетическими субстратами.

2. Изменение состава мембранных липидов и увеличение текучести мембран. В процессе охлаждения вязкость липидного бислоя мембран увеличивается. Переход мембранных липидов из жидко-кристаллического состояния в кристаллическое снижает проницаемость мембран, что увеличивает опасность образования льда внутри клетки, так как вода будет медленнее двигаться через мембрану к центрам кристаллизации в свободном пространстве и межклетниках. Одновременно нарушаются транспортные функции мембран, процессы фотосинтеза и образования энергии, а также функционирование мембранных белков.

Для предотвращения этих негативных явлений в ходе адаптации растений к низким температурам увеличивается текучесть мембран. Это является результатом увеличения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных фосфолипидах. Как было отмечено выше, замену в липидах насыщенных жирных кислот на ненасыщенные осуществляют десатуразы (см. параграф 1.4). Активность этих ферментов, а также экспрессия кодирующих их генов сильно возрастают в ответ на действие закаливающих температур. Десатурация мембранных липидов в условиях низких температур характерна как для морозостойких, так и для менее устойчивых к низким температурам сортов и видов.

• 3. Глубокое переохлаждение и постепенная дегидратация. Как было сказано выше, при понижении температуры в тканях спонтанно возникают микрокристаллики льда (микронуклеусы), из которых затем образуются тем более крупные кристаллы, чем больше свободной воды содержат клетки. Образование кристаллов льда может быть вызвано или стимулировано полисахаридами, белками и даже целыми бактериальными клетками, которые называют нуклеаторами льда. Многие растения, особенно древесные, в процессе адаптации к отрицательным температурам приобретают способность тормозить внутриклеточное образование кристаллов льда при температурах много ниже точки замерзания, т. е. в состоянии глубокого переохлаждения. Это состояние характеризуется наличием в протопластах высоких концентраций антииуклеаторов льда. Состояние глубокого переохлаждения поддерживается при отрицательных температурах не ниже -40°С, поскольку при более сильных морозах начинается спонтанное образование кристаллов льда. Однако внеклеточное образование льда начинается уже при -3 … -5°С. По мере понижения температуры кристаллы растут за счет присоединения молекул воды из протопласта, который остается незамерзшим. Превращается в лед только свободная вода. Чем меньше свободной воды в клетке, тем медленнее растут кристаллы льда, меньше обезвоживается клетка. Так, вполне созревшая и содержащая мало воды древесина в закончивших рост ветках деревьев гораздо выносливее к морозу, чем древесина растущих побегов, поскольку в таких уже заранее обезвоженных тканях даже при сильном морозе образуется лишь ничтожное количество льда. Постепенная дегидратация протопласта является одним из необходимых условий выживания растений при низких отрицательных температурах.
• 4. Ограничение роста внеклеточного льда и синтез антифризных белков. Растения, подобно полярным рыбам и насекомым, синтезируют антифризные белки (АФБ), которые тормозят рост кристаллов льда, не влияя при этом на температуру замерзания раствора. Синтез АФБ индуцируется низкими температурами, и они связываются с кристаллами льда, предотвращая или замедляя их дальнейший рост. АФБ обнаружены у растений 25—30 видов. Эти белки аккумулируются, прежде всего, в апопласте во время адаптации к холоду. В растениях озимой ржи обнаружено шесть антифризных белков с молекулярной массой от 16 до 35 кДа. В чувствительных к морозу растениях АФБ обычно не обнаруживаются. Удивительно, что некоторые из них обладают большим сходством с ферментами эндохитиназой и [3-1,3-глюконазой, которые защищают растение от биопатогенов. Однако АФБ растений значительно менее эффективно тормозят образование льда. Защитный механизм АФБ растений пока изучен недостаточно.
• 5. Синтез стрессорных белков холодового ответа. Для развития устойчивости к морозу необходим синтез белка. В настоящее время идентифицировано несколько генов и кодируемых ими белков холодового ответа, которые часто обозначают как COR-белки (от англ, cold-responsive proteins). Наиболее изучены COR-белки арабидопсиса. Они кодируются четырьмя семействами генов. Промоторы всех этих генов имеют одинаковый регуляторный элемент CRT/DRE, с которым связывается трансфактор CBFI. Этот регуляторный белок может запускать экспрессию сразу всех COR- генов. Кодируемые этими генами белки крайне гидрофильны и, в отличие от подавляющего большинства других клеточных белков, сохраняют свою стабильность даже при кипячении. Один из СОй-генов арабидопсиса экспрессируется в ответ на низкую температуру, засуху и АБК. Кодируемый этим геном белок (COR5a) синтезируется в цитозоле и затем транспортируется в хлоропласт. Этот белок повышает криостабильность (от греч. kryos — холод и лат. stabilis — устойчивый) плазмалеммы, а также хлоропластных мембран, но не влияет на морозоустойчивость целого растения. Повышение устойчивости к низким температурам всего растительного организма зависит от одновременной работы всех имеющихся COR-теиов. Следовательно, морозоустойчивость является признаком, контролируемым многими генами.

При адаптации к морозу синтезируются также аналоги LEA-белков, которые, как мы знаем, важны при адаптации растений к водному дефициту (см. подпараграф 9.3.3). Помимо этого, синтезируются десатуразы жирных кислот, ответственные за повышение степени текучести мембран, молекулярные шапероны, которые являются гомологами БТШ-90 и БТШ- 70 и предотвращают денатурацию белков при действии отрицательных температур. Ключевое значение для запуска и координации сгрессорного ответа имеет стимуляция холодом экспрессии генов, кодирующих компоненты рецепции и трансдукции сигнала, а также регуляторные белки.

К ним принадлежат МАРК (митогенактивируемые киназы), кальцийзависимые протеинкиназы и регуляторные 14—3—3 белки. Продукты этих генов повышают устойчивость к морозу, регулируя экспрессию СОИ-генов.

Помимо перечисленных выше полипептидов, в условиях гипотермии все живые организмы синтезируют эволюционно консервативные белки, содержащие в своей структуре так называемый домен (фрагмент) холодового шока и обладающие способностью связывать ДНК и РНК. Внутриклеточное содержание этих белков значительно возрастает в ответ на понижение температуры благодаря избирательной стабилизации их мРНК. В основе защитного действия этих белков лежит их способность связываться с промоторами и энхансерами и регулировать экспрессию многих генов, вовлекаться в репликацию ДНК, а также в процесс сплайсинга мРНК.

Таким образом, в настоящее время имеются прямые доказательства участия регулируемых низкой температурой генов и синтеза кодируемых ими белков в повышении морозоустойчивости и выживания растений.