Рост и развитие фолликулов

Ооцит млекопитающих развивается в составе фолликула — основной функциональной единицы яичника. Фолликулярные клетки, окружающие ооцит, изолируют его от окружающей среды. Через плотные контакты из фолликулярных клеток поступают питательные вещества и биологически активные вещества, необходимые для роста и созревания фолликулов. Еще в раннем пренатальном онтогенезе герминативный эпителий яичников млекопитающих дифференцируется на оогонии и фолликулярные клетки. Предполагается, что именно первичные фолликулярные клетки тормозят митотическое размножение оогоний и вызывают начало мейоза. В ходе пролиферации и дифференцировки однослойный фолликулярный эпителий преобразуется в многослойный, выделяется прилегающая к ооциту зона гранулезных клеток, а позднее — базальная мембрана (неклеточное соединительнотканное образование, разделяющее зоны гранулезы и теки). Рост фолликула сопровождается параллельным ростом ооцита, накоплением в нем белков, нуклеиновых кислот, ферментов, кортикальных гранул, других цитоплазматических включений. Фолликулярные клетки участвуют также в образовании жидкости, заполняющей формирующуюся внутри фолликула полость, а клетки гранулезы, прилегающие к ооциту (клетки яйце;

Рис. 9 Основные стадии развития фолликула (Carlson, 1981; по Гилберт С., 1993):

1 — клетки гранулезы; 2 — клетки теки; 3 — полость; 4 — corona radiata; 5 — zona pellucida; 6 — ооцит; 7 — гранулеза.

носного бугорка, или кумулюса) — в образовании вокруг яйцеклетки блестящей оболочки, состоящей из гликопротеидов.

К моменту полового созревания у самок в корковом слое яичников присутствует большое количество различных по размерам и фазам роста первичных (примордиальных) и развивающихся фолликулов. Развитие фолликулов и яйцеклеток является циклическим процессом. Одновременно развивается один или несколько фолликулов и соответственно одна или несколько яйцеклеток. Выделяют несколько стадий развития фолликула (рис. 9).

В яичнике новорожденных самок присутствуют первичные фолликулы. Количество их достигает сотни тысяч. Каждый из них состоит из половой клетки (ооцита первого порядка), окружающего ее одного слоя фолликулярных клеток и соединительнотканной оболочки — теки. Во время развития эпителий фолликула из плоского становится сначала кубическим, а затем призматическим. Размножаясь, фолликулярные клетки окружают ооцит первого порядка сначала в два, а затем в несколько слоев. В результате формируются вторичные фолликулы.

В дальнейшем в центре фолликула появляется наполненная жидкостью полость, образующаяся из слившихся небольших наполненных жидкостью полостей между фолликулярными клетками. Вторичный фолликул превращается в третичный (антральный) фолликул, или Граафов пузырек. В процессе развития фолликула происходит рост ооцитов. Они покрываются блестящей оболочкой, которая состоит из мукополисахаридов и является продуктом обмена веществ ооцита. Вокруг ооцита фолликулярный эпителий располагается в виде правильных радиальных лучей (лучистый венец). Эти клетки выполняют по отношению к ооциту трофическую (питательную) роль. По мере роста зрелый фолликул начинает выпячиваться над поверхностью яичника в виде прозрачного пузырька.

Развитый фолликул представляет собой пузырек, центр которого заполнен жидкостью. Полость окружена зоной фолликулярных клеток, располагающихся в 10−12 слоев. На участке, где находится яйцеклетка, фолликулярные клетки образуют утолщение, которое вдается в полость фолликула в виде бугорка. На его вершине расположена окруженная лучистым венцом яйцеклетка.

Снаружи фолликул покрыт соединительнотканной оболочкой, образованной из стромы яичника. В ней различают два слоя: внутренний, прилегающий к клеткам гранулезы, и наружный — к строме яичника. Во внутреннем слое имеется много мелких кровеносных сосудов и клеток. Он отделен от клеток гранулезы соединительнотканной мембраной. Клетки внутренней оболочки в строении сходны с клетками желтого тела, поэтому их иногда называют текалютеиновыми. Клетки внутреннего слоя служат основным местом выработки прогестерона, андрогенов и частично эстрогенов. Наружный слой оболочки беден кровеносными сосудами. В том месте, где фолликул выступает над поверхностью яичника, он покрыт снаружи также белочной оболочкой яичника и слоем зародышевого эпителия.

Из растущих фолликулов только часть развивается полностью. Большинство из них погибает на разных стадиях развития. Это явление носит название атрезии фолликулов. Учитывая, что атрезия фолликулов происходит постоянно, в последнее время большинство исследователей приходит к выводу, что она является физиологическим явлением, необходимым для нормального течения циклических процессов в яичниках. В яичнике млекопитающих число генеративных клеток в сотни раз превышает число потомков, которых может выносить и выкормить животное.

Большинство овариальных фолликулов на разных стадиях развития подвергается атрезии. Например, в яичниках половозрелых коров атрезией затронуто 69,8% однослойных фолликулов и 10−41% многослойных. По данным ряда исследователей при рождении в яичниках собак насчитывается 700 000, при наступлении половой зрелости — 250 000, в возрасте 5 лет — 33 000, в возрасте 10 лет — 500 первичных фолликулов (МсБопаИ, 1980; по Дюльгер, 2002).

Сейчас уже известно, что атрезия фолликулов происходит путем апоптоза. Сначала погибает ооцит, что приводит к образованию неправильной формы фолликула, состоящего только из клеток гранулезы. Это позволяет предположить, что ооцит имеет свой собственный генетический механизм апоптоза. Судьба фолликула зависит от баланса экспрессии апоптотических и антиапоптотических факторов. Среди этих факторов протеины Ьс1−2 и Ьах играют основную роль. С одной стороны, у мышей, лишенных гена Ьс1−2, снижается число фолликулов, присутствующих после рождения, а повышеная экспрессия этого белка приводит к торможению апоптоза фолликулов. С другой стороны, дефицит Ьах приводит к продолжению репродуктивного периода. В целом исследования показывают, что даже если эти протеины вовлечены в регуляцию апоптоза фолликулов, фактор, инициирующий каскад апоптоза в физиологических условиях, остается неизвестным.

По-видимому, первичные изменения в атретичных фолликулах происходят в ооцитах, что в дальнейшем приводит к перестройке обмена веществ в клетках гранулезы. В клетках гранулезы снижается синтез эстрогенов из тестостерона, и в фолликулах образуется повышенное количество андрогенов, препятствующих нормальному развитию фолликула. Механизм, посредством которого происходит отбор фолликула для овуляции — одна из интригующих и еще не разрешенных тайн биологии.

Для каждого вида характерна определенная частота овуляции, на которую влияют генетические, сезонные, пищевые и некоторые другие внешние факторы. Вероятно, рост фолликула может происходить в строго определенных гормональных условиях, причем эти условия меняются в зависимости от стадии развития фолликула. Поскольку фолликулы растут асинхронно, очевидно, что в каждый из отдельно взятых дней секреция гонадотропинов будет оптимальной для ограниченного числа фолликулов. У человека и у других видов, для которых характерна одиночная овуляция, происходит отбор только одного фолликула.

Известно, что в фолликулярной жидкости крупных и здоровых фолликулов коров и человека содержится больше ФСГ и ЛГ, чем в малых и атретических фолликулах. Предполагают, что избирательное проникновение ФСГ из крови в один из фолликулов является одним из пусковых механизмов выделения «ведущего» фолликула.

У высших приматов отбор этого фолликула, вероятно, осуществляется в течение первых нескольких дней после начала менструации. После того, как отбор уже произошел, фолликул, который в конечном итоге будет овулировать, становится доминирующим, т. е. он растет и дифференцируется со скоростью, определяемой экспоненциальной зависимостью, тогда как другие полостные фолликулы становятся атретическими. Подсчитано, что у женщин фолликул, который будет овулировать, на 1-й день цикла равен приблизительно 2 мм, ко времени овуляции спустя 14 суток он увеличивается приблизительно до 23 мм. Этот рост сопровождается 100-кратным увеличением объема фолликулярной жидкости, а число гранулезных клеток возрастает с 0,5−10® до 50 10⁶. Доминирующий фолликул секретирует увеличивающиеся количества 17(}-эстрадиола, отчего уровень этого гормона в крови экспоненциально возрастает. Увеличение роста преовуляторного фолликула происходит на фоне падения концентрации ФСГ в периферической крови. Представляется вероятным, что доминирующий фолликул становится относительно менее зависимым от уровня ФСГ в крови, поскольку фолликулярная жидкость теперь сама содержит ФСГ и эстрадиол в высоких концентрациях.

Когда доминирующий фолликул достигает зрелости, секреция эстрадиола достаточно интенсивна для того, чтобы индуцировать эффект положительной обратной связи, вследствие чего происходит массированное выделение гипофизарного ЛГ. ЛГ вызывает ряд изменений в структуре и функции фолликула, а также стимулирует возобновление мейоза в ооците. В конечном итоге эти структурные и функциональные преобразования приводят к разрыву стенки фолликула и освобождению созревающей яйцеклетки — овуляции (рис. 10).

Рис. ю.

Цикл с положительной обратной связью в фолликулярных клетках млекопитающих (Гилберт С., 1993)

Каким образом ЛГ нарушает мейотический блок?

Поиски ответа на этот вопрос привели к интенсивному изучению природы блока мейоза. Эта стадия оогенеза очень важна, поскольку в это время ооцит растет, в нем дифференцируются специфические структуры и он приобретает способность завершить деления мейоза. Ранние исследования показали, что заключенный в фолликул ооцит (как in vivo, так и in vitro) без воздействия гонадотропинов не созревает, тогда как ооцит, извлеченный из фолликула, способен возобновить мейоз даже без гормональной стимуляции.

Отсюда можно заключить, что при нормальном развитии мейоз ингибирован фолликулярными клетками, а его инициация вызывается гонадотропинами. Это предположение о регуляции мейоза фолликулярными клетками подтверждается данными о том, что клетки кумулюса связаны с ооцитом посредством своих отростков, пронизывающих блестящую оболочку, и что эти отростки несут щелевые контакты, позволяющие небольшим молекулам проходить между клетками кумулюса и ооцитом.

Наблюдения, свидетельствующие о том, что при повышении уровня цАМФ наблюдается ингибирование созревания ооцита, послужили основанием для предположения, что блок мейоза поддерживается транспортом цАМФ через щелевые контакты из фолликулярных клеток в ооцит. Всплеск синтеза ЛГ мог бы служить триггером созревания, если бы он прерывал коммуникации через щелевые контакты, подавляя таким образом транспорт цАМФ в ооцит. Несколько групп данных подкрепляют эту гипотезу.

Во-первых, снижение концентрации цАМФ играет решающую роль для возобновления мейоза. Дезинтеграция зародышевого пузырька может быть предотвращена, если в выделенных из фолликулов яйцеклетках ингибировать разрушение цАМФ или прямо воздействовать на них цАМФ. Снижение концентрации цАМФ в ооците происходит непосредственно перед возобновлением мейоза. Предполагается, что падение уровня цАМФ приводит к снижению концентрации цАМФ-зависимой протеинкиназы. Этот фермент, по-видимому, отвечает за фосфорилирование особых белков, которые в фосфорилированном состоянии поддерживали бы мейотический блок. Если ингибиторы этой протеинкиназы инъецировать в ооцит мыши, то мейоз может возобновиться даже в присутствии цАМФ.

Во-вторых, гонадотропины, по-видимому, ответственны за нарушение связи между ооцитом и фолликулярными клетками. Последние служат важным источником цАМФ ооцита, поэтому изменения концентрации цАМФ фолликулярных клеток скажутся на уровне цАМФ ооцита. Этим можно объяснить, почему окруженный фолликулярными клетками ооцит находится в состоянии блокированного мейоза и освобождается от этого блока при удалении фолликулярных клеток.

Всплеск синтеза гонадотропина, однако, может поднять концентрацию цАМФ фолликулярных клеток на новые уровни. В ответ на это повышение зрелые фолликулярные клетки синтезируют гиалуроновую кислоту, которая вызывает физический разрыв контактов между отростками фолликулярных клеток и ооцитом. В результате мостики между фолликулярными клетками гранулезы и ооцитом, по которым.

Рис. 11.

Последовательность событий, приводящих к возобновлению мейоза в ооцитах млекопитающих (Гилберт С., 1993)

перетекает цАМФ, прерываются, и ооцит млекопитающего возобновляет мейоз (рис. 11).

Ооциты являются электрогенными клетками, развитие которых блокируется на определенной стадии мейотического деления. У млекопитающих до приобретения Яйцеклеткой функциональной зрелости сохраняется тесный контакт между ней и окружающими ее клетками кумулюса. Подобные межклеточные взаимодействия осуществляются посредством плотных контактов (gap junctions). Интересно, что, несмотря на такую тесную взаимосвязь, клетки кумулюса и ооцит имеют различные мембранные потенциалы. Клетки кумулюса передают ооциту специфические электрические сигналы, которые либо поддерживают мейотический арест, либо снимают блок мейоза. В первом случае мембрана ооцита поддерживается в гиперполяризованном состоянии. В другом случае наступает деполяризация мембраны ооцита в результате действия гонадотропинов на кумулюсные клетки. Деполяризация клеток гранулезы, таким образом, является важным событием созревания фолликула. Эта гипотеза подтверждается тем, что пролиферация клеток гранулезы,.

Рис. 12.

Динамика активности ионных каналов в ооцитах млекопитающих (по ТозН Е., Вот Я. 2004)

синтез ими стероидов и апоптоз могут изменяться под действием избирательных антагонистов К⁺-каналов. Такая тесная связь между ооцитом и клетками гранулезы уменьшается в конце созревания благодаря разрушению плотных контактов и увеличению объема кумулюсных масс. Искусственное удаление кумулюса и выделение незрелых ооцитов также приводит к изменению мембранного потенциала.

Эксперименты на ооцитах крупного рогатого скота продемонстрировали, что в сложных метаболических преобразованиях ооцитов в ходе их созревания важную роль играет изменение внутриклеточной концентрации ионов кальция. Активность Са²⁺-каналов Ь-типа, локализованных в плазматической мембране ооцитов, уменьшается в ходе завершения мейотического деления.

Имеющаяся на сегодня картина динамики активности ионных каналов в мембране ооцитов млекопитающих представлена на рисунке 12. На стадии зародышевого пузырька наибольшей активностью обладают К⁴-каналы и Са²⁺-каналы Ь-типа. Их активность заметно снижается к метафазе второго мейотического деления.