Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы

1 Материалы и методы эмпирического исследования

1.1 Объект исследования и подготовка образцов почв к микробиологическому исследованию

1.2 Определение общей численности бактерий в почве

1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов

2 Результаты и обсуждение исследования Заключение Список использованных источников и литературы

Почва является основным депо разнообразных микроорганизмов на Земле [1;10]. Известно, что 60−90% биомассы Земли представлено микроорганизмами, населяющими, главным образом почву [2], причем их численность в почве, по сравнению с другими природными средами, выше на несколько порядков.

Микроорганизмы распределяются по всему почвенному профилю вплоть до подстилающей породы [1;10]. Значительный практический и теоретический интерес представляет вопрос о том, как изменяется численность микроорганизмов по почвенному профилю, а также динамка численности микроорганизмов в нижнем почвенном горизонте в силу новизны самой проблемы. Особенно это касается недостаточно исследованных почв, имеющих в своем профиле оглеенные горизонты.

В анаэробных условиях при участии гетеротрофных бактерий, использующих органическое вещество, при постоянном или периодическом увлажнении идет один из интересных почвообразовательных процессов — глееобразование [2;8]. Этот процесс сопровождается восстановлением Fe (III) до Fe (II) и выносом Fe (II)-соединений в нижние горизонты почвенного профиля. Глееобразование практически всюду может происходить в результате антропогенной деятельности, если она приводит к переувлажнению почв.

В условиях застойно-промывного режима в результате глееобразования происходит максимальный вынос не только железа, но и других металлов — марганца, алюминия, кальция, магния [8;9]. Изучение особенностей микроорганизмов глеевых почв весьма актуально, так как при антропогенном воздействии на почвенный покров, в том числе при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами, подобные почвы встречаются практически повсеместно. В Ярославской области почвы с различной степенью оглеения занимают около 18,3%, что составляет 662,5 га земель.

Почвенные микроскопические грибы и бактерии являются практически единственными деструкторами органического вещества, поступающего в почву в виде растительного опада, мертвых животных, а также органических ксенобиотиков [4;9]. Важным микробиологическим показателем состояния почвы является соотношение численности бактерий двух физиологических групп, которые входят в функциональную структуру почвы: сапротрофов и олиготрофов [2;3]. Сапротрофы разлагают разнообразные органические соединения в значительной концентрации, попадающие в почву. Олиготрофы способны ассимилировать органические соединения в условиях их низкой концентрации, при этом они разлагают остаточные количества органических соединений, «рассеивающиеся» в почве при деятельности сапротрофов и автохтонных микроорганизмов, разлагающих почвенный гумус [1;3].

Целью работы было изучение динамики численности бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить общую численность бактерий в 5 горизонтах почвенного профиля дерновой альфегумусовой глеевой почвы путем прямого счета по методу Виноградского-Брида.

2. Определить численность сапротрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.

3. Определить численность олиготрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.

4. Проанализировать полученные данные по общей численности, численности сапротрофов и численности олиготрофов.

1 Материалы и методы исследования

1.1 Объект исследования и подготовка образцов почвы

к микробиологическому исследованию

Объектом исследования служили пять образцов дерновой альфегумусовой глеевой почвы, отобранной в 5 км от поселка Дорожный Ярославского района Ярославской области. Охарактеризуем горизонты по мере увеличения глубины их залегания:

1. почвенный образец взят из темногумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 7 — 12 см, цвет темно-серый, структура зернистая, наблюдается обилие мелких корней;

2. образец взят из горизонта темногумусового с признаками оглеения почвенного разреза. Глубина 12 — 16 см, цвет темно-серый, наблюдаются мелкие серые, рыжие и сизые пятна, в качестве включений представлены мелкие корни, механический состав определяется как среднесуглинистый;

3. образец взят из светлогумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 16 — 23 см, цвет серый, наблюдаются рыжие и сизые пятна, механический состав определяется как среднесуглинистый, структура зернисто-комковатая, в качестве включений представлены мелкие корни;

4. образец взят из иллювиально-гумусово-железистого горизонта почвенного разреза. Глубина 25 — 45 см, преобладающий цвет светло-бурый с многочисленными охристыми, сизыми и голубыми затеками и пятнами; до глубины 45 см заметны затеки гумусового вещества; горизонт плотного сложения, сильно увлажнен; механический состав определяется как легкоглинистый;

5. образец взят из глеевого горизонта почвенного разреза. Глубина 45 — 70 см, цвет темно-серый, присутствуют кирпично-красные включения; горизонт более уплотнен, с глубины 70 см просачивается вода.

Подготовку почвенных образцов проводили согласно существующим рекомендациям.

1. Почву высыпали на сухое стекло, тщательно перемешивали и раскладывали ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляли мелкие корешки и другие посторонние включения. Из разных мест рассыпанной почвы отбирали небольшие порции и взвешивали на технических весах по 1 г почвы из каждого горизонта.

2. Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных частиц, каждую навеску почвы вносили в отдельную колбу, содержащую 100 мл стерильного физиологического раствора (0,5% раствор хлорида натрия). Колбы встряхивали на качалке в течение 30 минут.

1.2 Определение общей численности бактерий в почве

Общее количество бактерий в почве учитывали прямым счетом на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида) [6;7].

1. Пять предметных стекол обезжиривали и на каждом обводили карандашом по стеклу квадрат со стороной 15 мм.

2. Бактериальную суспензию объемом 0,1 мл из соответствующей колбы наносили на стекло и равномерно распределяли по площади квадрата.

3. Препараты подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки (проносили над пламенем 2 — 3 раза) и окрашивали 2 минуты фуксином. Краситель сливали, препарат промывали и высушивали между полосками фильтровальной бумаги.

4. Подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп марки «Биолам» с масляной иммерсионной системой при увеличении 10Ч1,0Ч100.

Для прямого счета микробных клеток вставляли в окуляр микроскопа сеточку Гаженко, 9 маленьких квадратиков которой составляют поле зрения. Просматривали 15 полей зрения.

Общую численность бактерий в 1 г почвы (N_общ.) определяли по формуле:

S Ч Уn_i

N _общ. = zЧ sЧv Ч100 [кл/г], где

S — общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм²);

Уn_i — сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;

z — количество просмотренных полей зрения (15);

s — площадь одного поля зрения (1089Ч10^-6 мм²);

v — объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);

100 — разведение первоначального образца почвы в 100 раз.

Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.

1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов

Определение количества клеток сапротрофов (N_сапр.) проводили высевом на жидкую питательную среду — мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки — 17,9; NaCl — 7,7 ± 0,3; вода дистиллированная — 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10^-1 до 10^-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 ⁰С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].

Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава [11]: Na₂HPO₄ — 0,8 г; KH₂PO₄ — 0,5 г; NH₄Cl — 0,5 г; MgSO₄ — 0,2 г; CaCl₂ — 0,1 г; FeSO₄Ч7H₂O -15 мг; дрожжевой экстракт — 0,1 г; пептон — 0,2 г; агар — 15 г; глюкоза — 0,2 г; вода дистиллированная — 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (N_олиг.) определяли методом высева по Коху. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10^-1 до 10^-9. По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию ч², рассчитываемому по формуле [7]:

(n_i — n)²

ч ² = п ,

где п_i — число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п — их среднее значение.

Различие считается значимым при ч ² не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:

nЧr

N_олиг. = v [кл/г],

где п — среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r — величина разведения; v — объем образца, посеянного на чашку (мл).

Кроме того, рассчитывали отношение N_сапр. к N_общ. для каждого горизонта.

2 Результаты и обсуждение исследования

Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.

Таблица 1

Общая численность бактерий в почвенном профиле

дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Рис. 1. Динамика общей численности бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N — численность бактерий

(Ч 10⁹ кл/г почвы).

Как видно из табл. 1 и рис. 1, максимальное значение общей численности бактерий (N_общ.) — 6,2Ч10⁹ кл/г — наблюдали во втором горизонте, по сравнению с остальными четырьмя горизонтами. Этот факт можно объяснить тем, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества. Третий горизонт почвенного профиля уже более уплотнен, поэтому органическое вещество, накапливаясь во втором горизонте, является фактором, стимулирующим развитие в нем почвенных микроорганизмов.

Данные табл. 1 показывают, что N_общ. достоверно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта: от второго к пятому, самому нижнему. Полученный результат согласуется с тем фактом, что содержание органического вещества, необходимого для развития почвенных микроорганизмов, также снижается с увеличением глубины залегания горизонта. При переходе от верхнего горизонта к нижележащим изменяются также окислительно-восстановительные условия, pH и др.

Порядок величин N_общ. в каждом горизонте был одинаков — 10⁹ кл/г. По-видимому, в верхних более рыхлых горизонтах, куда поступает достаточное количество кислорода с поверхности, создались оптимальные условия для развития аэробных микроорганизмов. В нижележащих горизонтах содержание кислорода минимально, и прежний порядок значения N_общ. объясняется активным развитием анаэробов.

Численность сапротрофных бактерий (N_сапр.) уменьшалась от первого горизонта к третьему, причем резкое снижение численности — более чем в 6 раз — было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту (рис. 2А). N_сапр. (таб.2) в четвертом горизонте — 4,5Ч10⁴ кл/г — была незначительно выше, по сравнению с третьим — 2,0Ч10⁴ кл/г, — тогда как в пятом она опять понижалось до значения, отмеченного в третьем горизонте (рис. 2А). Как показано на рис. 2Б, численность олиготрофных бактерий (N_олиг.) последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5Ч10⁷ в первом до 1,5Ч10⁷ кл/г в пятом горизонте (таб.2).

Рис. 2. Численность сапротрофов (А) и олиготрофов (Б) в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N — численность бактерий (кл/г почвы)

Таблица 2

Численность сапротрофных и олиготрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы

В общем, N_сапр. находилась на уровне 10⁵ кл/г в первом, и 10⁴ кл/г в остальных горизонтах (прил. 3). N_олиг. соответствовала 10⁷ кл/г в каждом горизонте профиля. Таким образом, N_олиг. была меньше, чем N_сапр.: в первом горизонте в 100, а в остальных четырех — в 1000 раз. Выявленное значительное преобладание олиготрофов над сапротрофами свидетельствует о том, что в исследованной почве низкое содержание легкоразлагаемой органики [2], следовательно, данная почва не подвергалась антропогенному загрязнению. Бактерии функционируют в ней за счет органического вещества самой почвы. Сапротрофы, развивающиеся в условиях высокой концентрации органики [3;4], уже переработали ее большую часть. В настоящее время в исследованной почве доминируют олиготрофы, которым для существования необходимо низкое содержание органики в среде [2;4].

Интересным является факт, что для горизонтов с четвертого по пятый отмечаются признаки оглеения почвы — сизые и голубые пятна и затеки. В настоящее время известны три совокупные причины глеегенеза [5]: 1) высокая влажность; 2) наличие легкоразлагаемого органического вещества в избыточном количестве; 3) жизнедеятельность гетеротрофных микроорганизмов. Согласно нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического вещества.

Отношение N_сапр. к N_общ. составило величины порядка 10^-4 — 10^-5 (табл.3), что свидетельствует о климаксном состоянии микробоценоза и о доминировании бактерий, которые получают необходимые питательные вещества и энергию за счет использования трудноразлагаемых органических веществ почвы в течение длительного времени.

Таблица 3

Отношение общей численности к численности сапротрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Примечание: N_сапр. — численность сапротрофных бактерий (кл/г); N_общ. — общая численность бактерий (кл/г).

Заключение

1. Общая численность бактерий снижается с глубиной залегания почвенного горизонта, максимальное значение — 6,2Ч10⁹ кл/г — наблюдается во втором горизонте за счет того, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества.

2. Количество сапротрофных бактерий уменьшалось от первого горизонта к третьему — от 2,5Ч10⁵ до 1,4Ч10⁴ кл/г, — причем резкое снижение численности — более чем в 6 раз (от 2,5Ч10⁵ до 4,0Ч10⁴ кл/г) — было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту.

3. Численность олиготрофных бактерий последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5Ч10⁷ в первом до 1,5Ч10⁷ кл/г в пятом горизонтах.

4. Отношение численности олиготрофных бактерий к сапротрофным для первого горизонта составляет величину порядка 10², а в остальных четырех — 10³, что свидетельствует о значительном преобладании олиготрофов над сапротрофами.

5. Отношение численности сапротрофных бактерий к общей численности бактерий составляет величины порядка 10^-4 — 10^-5, что свидетельствует о климаксном состоянии микробоценоза и о доминировании бактерий, жизнедеятельность которых связана с использованием трудноразлагаемых органических веществ почвы.

6. Согласно нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического вещества.

Список использованных источников

и литературы

1. Бабьева И. П. Биология почв / И. П. Бабьева, Г. М. Зенова. — М.: МГУ, 1989. — 336 с.

2. Емцев В. Т. Микробиология / В. Т. Емцев, Е. Н. Мишустин. — М.: Дрофа, 2005. — 445 с.

3. Добровольская Т. Г. О показателях структуры микробных сообществ / Т. Г. Добровольская, И. Ю. Чернов, Д. Г. Звягинцев // Микробиология. — 1997. — Т.66. — № 3. — С. 408−414.

4. Заварзин Г. А.

Введение

в природоведческую микробиологию / Г. А. Заварзин, Н. Т. Колотилова. — М.: Книжный дом «Университет», 2001. — 256 с.

5. Зайдельман, Ф. Р. Процесс глееобразования и его роль в формировании почв / Ф. Р. Зайдельман. — М.: МГУ, 1998. — 316 с.

6. Кузнецов С. И. Методы изучения водных микроорганизмов / С. И. Кузнецов, Г. А. Дубинина. — М.: Наука, 1989. — 288 с.

7. Практикум по микробиологии / Под ред. Н. С. Егорова. — М: МГУ, 1976. — 307 с.

8. Соединения железа, алюминия, кремния и марганца в почвах лесных экосистем таежной зоны / М. Мурашкина, Г. Копцик, и др. // Почвоведение. — 2004. — № 1. — С. 40- 49.

9. Умаров М. М. Экология и почвы / М. М. Умаров. Избранные лекции 1−7 школ, М.: Пущино, 1998, 15−21 с.

10. Экология микроорганизмов: учебник / А. И. Нетрусов, Е. А. Бонч — Осмоловская, и др. — М.: Издательский центр «Академия», 2004. — 272с.

11. Hottes A.K. Transcriptional profiling of Caulobacter crescentus during growth on complex and minimal media / A.K. Hottes, M. McEwen, D. Yang et al. // J. Bacteriol. — 2004. — V. 186. — № 5. — P. 1448−1461.