Исследование высших грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides в качестве возможных продуцентов гидрофобинов

1 Аналитический обзор

1.1 Гидрофобины

1.1.1 Общая характеристика гидрофобинов

1.1.2 Структура и поверхностные свойства гидрофобинов

1.1.2.1 Гидрофобины I класса

1.1.2.2 Гидрофобины II класса

1.1.3 Функции гидрофобинов

1.1.4 Самосборка гидрофобинов

1.1.5 Пенообразующие и пеностабилизирующие свойства гидрофобинов

1.2 Pleurotus ostreatus

1.3 Coprinus lagopides

2 Цели и задачи работы

3 Экспериментальная часть

3.1 Объект исследования

3.2 Общий ход работы

3.3 Материалы и методы исследования

3.3.1 Глубинное культивирование гриба

3.3.2 Отделение биомассы продуцента

3.3.3 Определение влажности биомассы

3.3.4 Выделение гидрофобинов

3.3.4.1 Выделение гидрофобинов из культуры гриба

3.3.4.1.1 Экстракция гидрофобинов из биомассы

3.3.4.1.2 Экстракция гидрофобинов из плодовых тел

3.3.4.1.3 Выделение гидрофобинов из нативного раствора

3.3.4.2 Выделение гидрофобинов из культуры гриба

3.3.4.2.1 Экстракция гидрофобинов из биомассы с промежуточной обработкой спиртом

3.3.4.2.2 Экстракция гидрофобинов из биомассы без промежуточной обработки спиртом

3.3.5 Определение количества белка

3.3.6 Разделение экстрактов методом ВЭЖХ

3.3.6.1 Молекулярная адсорбционная хроматография

3.3.7 Определение молекулярной массы (электрофорез)

3.3.7.1 Механизм разделения

3.3.7.2 SDS-PAGE по Лэммли

3.3.7.3 Визуализация продуктов разделения

3.3.7.4 Буферные системы

3.3.8 Оценка влияния полученного продукта на стабильность пены

3.3.9 Определение доверительного интервала

3.4 Результаты и обсуждения

3.4.1 Глубинное культивирование высших базидиомицетов

3.4.2 Динамика роста грибов в глубинной культуре

3.4.3 Определение влажности биомассы

3.4.4 Определение количества белка в экстрактах

3.4.5 Разделение с помощью ВЭЖХ

3.4.6 Электрофорез

3.4.7 Оценка пенообразующей и пеностабилизирующей способностей полученных экстрактов

4 Заключение и выводы Список использованных источников

Грибы чрезвычайно богаты различными биологически активными и ценными пищевыми веществами. Традиции использования грибов в пищу у разных народов уходят в глубину веков. Однако грибы могут использоваться не только в качестве богатых белком и витаминами пищевых продуктов, но и служить источником различных БАВ.

Широкие возможности для этого открывает глубинное культивирование грибов, позволяющее получить высококачественный грибной мицелий, по своему составу практически не отличающийся от плодовых тел. При этом глубинное культивирование грибов экономически более эффективно и позволяет получать биомассу гриба в значительно более короткие сроки при меньших затратах.

Особенно привлекательным является тот факт, что в результате ферментации одного гриба могут быть получены сразу несколько ценных веществ, что значительно снижает себестоимость конечных продуктов. Технология получения БАВ из грибов проста, оборудование занимает небольшую площадь. Налаженная технологическая цепь позволяет выпускать разные БАВ грибного происхождения. Производство БАВ является практически безотходным, так как все фракции после обработки находят применение.

В последние годы у высших грибов было выявлено наличие низкомолекулярных белков, названных гидрофобинами, которые обладают необычными поверхностно активными свойствами. Это низкомолекулярные белки, образующие стойкие эмульсии, по своим вкусовым качествам похожие на жиры. Они способны придать пенам, используемым в продовольственных продуктах, высокую стабильность. При этом эффект, вызываемый гидрофобинами, намного выше, чем у других стабилизаторов пены.

Присутствие гидрофобинов стабилизует пены таким образом, что в них в течение нескольких месяцев почти не наблюдается потеря воздушной фазы. Возможность получения стабильных пен и эмульсий откроет новые значительные возможности перед производителями пищевых продуктов по их улучшению с точки зрения функциональности, разработки новых текстур или снижения калорийности, что является очень актуальным в настоящее время.

Целью наших исследований было исследование высших грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides в качестве возможных продуцентов гидрофобинов.

1 Аналитический обзор

1.1 Гидрофобины

1.1.1 Общая характеристика гидрофобинов

Способность грибных организмов обитать в самых различных климатических зонах на разнообразных субстратах является результатом формирования в процессе эволюции специфических структур, защищающих мицелий от разрушительного действия различных факторов окружающей среды. Одним из эффективных средств защиты являются гидрофобины — важнейшие структурные белки клеточной поверхности. Название гидрофобин впервые было введено из-за высокого содержания в белке гидрофобных аминокислот (1). Гидрофобины обильно секретируются мицелием и выполняют широкий спектр функций в росте и развитии грибов. Они были открыты при поиске генов, экспрессирующихся при формировании воздушных гиф на мицелии Schizophyllum commune. Эти гены были впоследствии секвенированы. Продукт одного из них был обнаружен в клеточных стенках воздушных гиф (SC3), в то время как продукт второго (SC4) — в клеточных стенках гиф, формирующих плодовое тело.

Гидрофобины оказались совершенно новым классом белков, обладающих своеобразными физико-химическими свойствами. Для выделения гидрофобинов потребовалось применение методов, нетипичных для экстракции белков.

В дальнейшем было обнаружено, что гидрофобин SC3, выделенный из S. commune, обладал способностью к формированию гидрофобного слоя палочек или гидрофобиновой мантии in vitro на границе вода—воздух. Кроме того, этот же гидрофобин оказался посредником при прикреплении гиф S. commune к гидрофобным поверхностям.

Гидрофобины способны самостоятельно собираться на гидрофильных / гидрофобных границах раздела фаз в амфипатические мембраны, в результате чего изменяется характер целевой поверхности (например, между водой и воздухом, водой и маслом или водой и гидрофобным твердым веществом, таким как тефлон) делая эти поверхности гидрофобными или водоотталкивающими.

Разрушение гена, кодирующего гидрофобин, приводило к возникновению фенотипа, у которого смачивались конидиоспоры. На их поверхности отсутствовал характерный для конидий слой палочек — тесно упакованных переплетающихся пучков толщиной 10 нм, состоящий из гидрофобинов, ориентированных так, что гидрофобные аминокислотные остатки оказывались на поверхности, а гидрофильные — внутри.

Через некоторое время гидрофобино-подобные белки были обнаружены еще у ряда грибов.

Некоторые грибы содержат более одного гидрофобинового гена и большинство из гидрофобинов известны только как последовательности генов и их важная роль в росте и развитии грибов в основном выяснена на основе мутагенеза (удаление гена или разрушение). Только несколько гидрофобинов были выделены и изучены на уровне белка.

1.1.2 Структура и поверхностные свойства гидрофобинов

В семейство гидрофобинов входят небольшие секретируемые белки (100±25 аминокислотных остатков), содержащие типичную N-концевую последовательность сигнала секреции. Степень гомологии аминокислотных остатков между гидрофобинами невелика. Структура гидрофобинов представлена двумя структурными доменами, каждый из которых содержит четыре остатка цистеина, вовлечённых в образование внутримолекулярных дисульфидных мостиков, в соответствии с рисунком 1.

Рисунок 1 — Двухдоменная структура гидрофобинов Первому остатку цистеина предшествует сигнальная последовательность и слабоконсервативные N-концевые сегменты — наиболее вариабельные по аминокислотному составу и длине участки белковой молекулы, которые, кажется, не имеют решающего значения для структурной целостности белков или их поверхностной активности. Остатки цистеина формируют четыре внутримолекулярных дисульфидных мостика между остатками цистеина 1 и 2, 3 и 4, 5 и 6, 7 и 8 с образованием двух пар петель, разделенных соединительным районом из 8-ми — 23-х аминокислотных остатков. Слабоконсервативные остатки (X) представлены, в основном, гидрофобными аминокислотами. Первая петля каждого домена содержит 5 — 9 аминокислотных остатков. Размер второй петли более изменчив, но содержит, по крайней мере, один остаток глицина, находящийся обычно рядом с гидрофобным аминокислотным остатком.

Распределение цистеина и группировка гидрофобных и гидрофильных остатков позволяют гидрофобинам быть разделенными на два класса: I и II. Агрегаты, образованные из этих двух классов могут быть выделены на основе их растворимости и морфологии.

Гены гидрофобинов класса I были выделены из аскомицетов и базидиомицетов, в то время как гены, кодирующие гидрофобины класса II у базидиомицетов, выявлены не были.

Гидрофобины класса II, как правило, меньше, чем белки класса I и показывают значительно больше сходства в аминокислотных последовательностях друг у друга в соответствии с рисунком 2.

Показаны только аминокислоты между первым и последним остатком цистеина из-за высокой вариабильности последовательности на концах (24). Консервативные остатки цистеина со структурами консервативных дисульфидных связей, указаных скобками, выделены желтым цветом. Использованные аббревиатуры: SC3, S. commune; SC4, S. commune; EAS, N. crassa; MPG1, М. grisea; HCF1, С. fulvum; ABH1, А. bisporus; PRI2, А. aegerite; RODA, A. Fumigatus; HFBI, T. Reesei; HFBII, T. Reesei; CU, O. ulmi; CRP, C. parasitica; HCF6, C. fulvum; MGP, M. grisea; HYD4, G. moniliformis и SRH1, T. Harzianum.

Рисунок 2 — Сравнение аминокислотной последовательности I и II классов гидрофобинов Гидрофобины класса I собираются в агрегаты, которые стабильны к действию детергентов (даже под действием 2% SDS при 100 ° С) и этанола и могут быть диссоциациированы только высокой концентрацией кислот (например, муравьиная кислота или чистая трифторуксусная кислота), а комплексы гидрофобинов класса II, которые менее стабильны, могут диссоциировать до мономеров под действием 60% этанола или 2% SDS. Большинство гидрофобинов из класса I формируют микроскопически идентифицируемые палочковые структуры вне грибной клеточной стенки (2,3,4). Гидрофобины класса II формируют сборки, у которых отсутствуют определенные палочковые структуры и они могут быть растворены в моющих средствах и спиртовых растворах. Однако следует оговориться, что это разделение отнюдь не окончательное, так как многие гидрофобины все еще не выделены и их физико-химические свойства не охарактеризованы.

Поверхностные свойства гидрофобинов были подробно изучены на белке SC3 Schizophyllum commune, в условиях как in vivo, так и in vitro. Гидрофобины отсутствуют у гиф, ассимилирующих пищу. Ген гидрофобинов начинает функционировать на 2-е — 3-и сутки роста. В это время происходит интенсивная секреция белка SC3 в среду, а также начинается формирование воздушных гиф. Было показано, что молекулы белка секретируются через апикальный кончик гиф при глубинном культивировании, но собираются в комплексы на разделе фаз клеточная стенка — воздух. При этом полимерную структуру гидрофобиновой мантии можно разрушить до мономеров, растворив её в трихлоруксусной кислоте, а затем, удалив кислоту, восстановить её снова.

Секретируемые в среду молекулы гидрофобинов не являются поверхностно активными, и поэтому не представляют опасности для клеточных мембран развивающихся гиф. Только после соединения за счёт гидрофобных взаимодействий на границе раздела гидрофильная-гидрофобная среда эти белки приобретают поверхностную активность. Формируется амфипатическая мембрана, гидрофобные аминокислотные остатки в которой ориентированы во внешнюю среду, а гидрофильные направлены в сторону клеточной стенки в соответствии с рисунком 3 а, б. SC3 формирует такую мантию только у воздушных гиф, покрывая наружный слой клеточной стенки.

а — появление воздушных гиф, б — гидрофобины плотно прикрепляют гифы к гидрофобным поверхностям.

1 — мономеры гидрофобинов, 2 — гидрофобиновая мантия.

Рисунок 3 — Функции гидрофобинов класса I

Внутренняя поверхность гидрофобиновой мантии, находящаяся в контакте с клеточной стенкой, по-видимому, содержит маннозу. Несмотря на то, что газовый обмен через гидрофобиновую мантию исследован недостаточно полно, существуют данные, что гидрофобиновый слой SC3 содержит поры. Важно, что секретируемые гидрофобины превращают все гидрофобные материалы в смачиваемые, включая материалы, подобные лигнину. Однако роль гидрофобинов в деградации лигнинов все еще остается неизвестной.

Формирование воздушных гиф связано с потерей ими способности к ассимиляции пищи, ровно, как и к возможности свободно секретировать гидрофобины в окружающую среду. Белки остаются в клеточной стенке и на поверхности раздела с воздухом формируют агрегаты — покрывающие гифы амфипатические слои. Способность к формированию амфипатической мантии очень важна на стадии образования воздушных гиф, поскольку гидрофобиновое покрытие помогает преодолеть поверхностное натяжение жидкости и, таким образом, стимулирует вертикальный рост гиф. Высокое поверхностное натяжение следует из того, что молекулы воды, расположенные на водной поверхности испытывают несбалансированное взаимодействие между соседними молекулами; взаимодействия с молекулами соседней фазы (например, воздуха) являются менее благоприятными, чем взаимодействие с молекулами внутри объема водной фазы. Это приводит к появлению большой связывающей силы между молекулами на поверхности раздела, чем между объемными молекулами (молекулами в объеме). Усиление взаимодействия между молекулами поверхности наблюдается как поверхностное натяжение. Гидрофобин SC3 из Schizophyllum commune может снизить поверхностное натяжение воды от 72 до 24 мН/м. (5) Это снижение поверхностного натяжения служит для того, чтобы гифы были способны выйти из водной среды и расти в воздухе.

Класс I гидрофобинов собираются на поверхностях воздушных гиф и спор в мозаичные структуры палочек около 10 нм в ширину. Это палочковое покрытие очень гидрофобно и считается, что оно служит для защиты воздушных структур грибов от намокания. Кроме того, воздушные каналы в грибных воздушных структурах, как сообщается, выстланы гидрофобинами (7,8). Это гидрофобное покрытие служит для защиты воздушных каналов от смачивания и для обеспечения успешного газового обмена. Эту мозаику параллельных палочек нанометрового размера можно наблюдать с помощью электронной микроскопии (ЭМ), в соответствии с рисунком 4, и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Рисунок 4 — электронная микрофотография гидрофобиновой пленки Мантия у представителей I и II классов гидрофобинов, по-видимому, неодинакова, и у представителей класса II она гораздо менее стабильна.

1.1.2.1 Гидрофобины I класса

Недавно с помощью ЯМР была открыта структура белка EAS из культуры Neurospora crassa, которая аналогична (26,27) структуре гидрофобиновых белков из класса II, HFBI и HFBII. Структура EAS сосредоточена на нерегулярном четырехнитевом ?-цилиндре с дополнительным антипараллельным двунитевым ?-слоем, прилагающимися к одной грани. Все ?-слои вторичной структуры антипараллельны. Две из четырех дисульфидных связей лежат в центре цилиндра, тогда как две другие соединяют внешнюю поверхность цилиндра с дополнительным слоем и близлежащей петлей. Однако, петля в-шпильки между третьим и четвертым цистеином в EAS показывает значительную конформационную свободу и чрезвычайно гидрофобную природу, в соответствии с рисунком 5 а (27). Одной из особенностей последовательности EAS является необычно низкое количество заряженных остатков (? 10% последовательности): пять аспартатов и три лизина. Из этих восьми остатков, шесть сосредоточены на отдельной поверхности белка. Остальная часть поверхности хорошо упорядоченного центра существенно не заряжена. Эта структура соответствует ее способности образовывать амфипатические полимеры. Сеть дисульфидных связей делает эти белки жесткими и основные конформационные изменения не представляются возможными. Петля между 3 и 4 цистеинами может быть прибавлена к цилиндру, образуя дополнительные в-структуры, которые присоединяются к следующему мономеру в образовании слоя палочек. В последнее время считается, что петля между 3 и 4 цистеинами не имеет важной роли в формировании или структуре палочек и что основным фактором в уникальных свойствах этих белков является амфипатическая структура центра, которая может быть сохранена во всех гидрофобинах несмотря на высокую степень вариациий последовательности в семье гидрофобиновых белков (28).

Один из наиболее изученных гидрофобинов класса I является SC3 из S. commune. Образцовая структура SC3 в растворе компактна, глобулярна и стабилизируется сетью дисульфидных мостиков. Две пары дисульфида связывают Nи С-концевые участки белка лимитируя гибкость всей молекулы. Nи C-концы и амфифильная в-шпилька расположены на одной стороне белка, в соответствии с рисунком 5 б. Гидрофобная петля находится на другой стороне, так что молекула SC3 также амфипатична как и EAS.

а — Ленточная схема растворенной структуры EAS. Цистеиновые боковые цепи показаны как желтые палочки. Положительно и отрицательно заряженные остатки показаны в виде синих и красных палочек, соответственно, б — характерная конформация модели SC3, дисульфидный мостик показан красным цветом.

Рисунок 5 — структура гидрофобинов класса I

1.1.2.2 Гидрофобины II класса

Кристаллические структуры двух гидрофобинов класса II, HFBI и HFBII из Thrichoderma reesei были определены рентгеновской кристаллографией (29,30,31), также был выполнен ряд других исследований на этих белках. Конечно, гидрофобины класса II легче обрабатываются, чем I класс белков из-за их более низкой склонности к агрегации.

Гидрофобиновая складка компактна и глобулярна и состоит из малого антипараллельного в-цилиндра, образованного двумя в-шпильками, связаными с вытянутой б-спиралью в соответствии с рисунком 6 а, б. б-спираль связана с внешней стороной цилиндра через дисульфидную связь, а другая дисульфидная связь участвует в перекрестной связи двух нитей в каждой из двух в-шпилек.

а — Изображение основной структуры белка показывает в-цилиндр, образованный двумя в-шпильками (зеленый) и связывающейся б-спиралью (красный). Дисульфидные связи цистеиновых остатков показаны желтым цветом. б — Поверхностное представление HFBII, в котором боковые цепи сохранненного гидрофобного патча показаны и окрашены зеленым цветом. N-и C-концы окрашены в синий и красный, соответственно. с — Две конформации наблюдались в рентгеновской кристаллической структуре HFBI. Наложение двух различных молекул HFBI (показано оранжевым и голубым) в асимметричный блок с гибкой петлей, указанной черной стрелкой (24).

Рисунок 6 — рентгеновская кристаллическая структура HFBII (30)

Эти две последние дисульфидные связи являются полностью закрытыми внутри цилиндра и находятся на противоположных концах, тем самым придавая высокую устойчивость структуре. Четвертая дисульфидная связь соединяет N-конец петли с центром в-циллиндра.

Общая топология HFBI и HFBII одинакова, однако, наблюдалась некоторая гибкость в структуре HFBI. Асимметричная единица HFBI содержит четыре молекулы, и есть одна петля с семью остатками, которая принимает различные конформации в двух из этих четырех молекулах по сравнению с двумя другими в соответствии с рисунком 6 с.

Уникальная и удивительная особенность структуры HFBII состоит в том, что около 80% гидрофобных боковых цепей находятся на поверхности белка, вместо того, чтобы иметь гидрофобные остатки внутри белка. Эта структура, вероятно, стабилизируется вышеупомянутой сетью дисульфидных связей. Гидрофобные алифатические аминокислоты на поверхности белка формируют плоскую гидрофобную область называемую гидрофобным патчем (рисунок 7 б). Этот гидрофобный патч составляет 12% от общей площади поверхности HFBII. Поверхность белка, иначе, в основном гидрофильна, и, таким образом, поверхность делится на гидрофобную и гидрофильную части.

Эта амфифильная структура управляет свойствами HFBI и HFBII, такими как поверхностная активность и поверхностная адсорбция.

1.1.3 Функции гидрофобинов

Некоторые из гидофобинов, кодируемые генами представителей Homobasidiomycetes, обильно секретируются погруженными гифами первичного и вторичного мицелия. Все они, по-видимому, имеют отношение к формированию воздушных гиф и плодовых тел и помогают преодолеть поверхностное натяжение водной среды. Другие гидрофобины синтезируются только вторичным мицелием, некоторые — только в плодовых телах. Для гидрофобина SC4 у S. commune и АВН1 у Agaricus bisporus выявлено, что они выстилают воздушные каналы плектенхимы плодовых тел.

Некоторое время шли споры о том, имеют ли отношение гидрофобины к патогенезу и вирулентности. Однако генетические исследования с мутантами по CU из Ophiostoma ulmi и CRYP из Cryptonectria parasitica показали, что эти гидрофобины не имеют прямого отношения к патогенности. Участие гидрофобинов CU и CRYP в заражении растения, по-видимому, состоит в том, что они, предохраняя внедряющегося паразита от защитных реакций со стороны пораженного растения, стимулируют инвазию.

Было выявлено, что все гидрофобные поверхности индуцировали развитие Magnaporthe grisea. По-видимому, прорастающие гифы патогена были способны ощущать характер поверхности как сигнал к дальнейшему развитию. Ген MPG1 усиленно экспрессировался во время формирования апрессориев у М. grisea. Споры мутантного штамма при попадании на растение-хозяина были неспособны к формированию апрессориев. Формирование гидрофобиновой мантии между гидрофильной клеточной стенкой паразита и восковым покрытием растения является, по-видимому, сигналом для формирования апрессория.

При поражении насекомых Metarhizium anisopliae адгезия паразита к гидрофобной кутикуле гусеницы инициировала инфекцию.

У некоторых паразитов человека, таких как Coccidioides imidis и Aspergillus fumigatus, а также у многих дерматофитов гидрофобины выявлены на поверхности спор. Таким образом, хотя и показано, что эти белки не являются токсинами, они косвенно, через активное рассеивание спор паразита способствуют распространению инфекции.

Симбиоз всегда включает тесный контакт поверхности грибных гиф с поверхностью тканей партнера. Подобное взаимодействие, по-видимому, не обходится без участия гидрофобинов. Так, в процессе формирования эктомикоризы Pisolithus tinctorius с корнями Eucalyptus globulus была выявлена высокая степень экспрессии двух генов (HydPtl и HydPt2), кодирующих гидрофобины. Авторы предполагают, что эти гидофобины участвуют в агрегации гиф в процессе обволакивания корня эвкалипта. Не исключено также, что на первых этапах колонизации растения гидофобины стимулируют прикрепленные гифы к корню.

Другой вид симбиоза, связанный с гидофобинами, — это лишайники. Исследования с помощью электронной микроскопии показали наличие гидрофобиновой мантии на границе таллома с воздухом, а также вокруг слизи, предназначенной для плотной адгезии мицелия и водоросли, составляющих тело лишайника. Однако к настоящему времени гидрофобины из лишайников не выделены.

1.1.4 Самосборка гидрофобинов

Характерным свойством гидрофобинов является адсорбция на гидрофобных-гидрофильных границах раздела фаз, на которых они образуют амфифильные пленки (32−34). Граница раздела фаз может быть между твердым веществом и жидкостью, жидкостью и жидкостью или жидкостью и паром. Таким образом, гидрофобины очень поверхностно-активны. В ранних исследованиях было обнаружено, что гидрофобины самостоятельно собираются в агрегаты и образуют различные типы самоорганизующихся структур (32). Агрегаты, образованные классом II гидрофобинов более растворимы, чем агрегаты гидрофобинов I класса (32,35).

Способность снижать поверхностное натяжение воды, как сообщалось для гидрофобинов класса I: ABH3, SC3 и SC4 и класса II: CFTH1, CRP и HFBII, указывает на то, что эти белки мигрируют в поверхность раздела вода-воздух. Гидрофобины способны стабилизировать капли масла в воде. Например, было показано, что SC3 формируют пленку вокруг капель масла в воде (6,36). Кроме того сообщается, что HFBII стабилизируют полиненасыщенные жирные кислоты в масло-водных эмульсиях (37).

Гидрофобиновые пленки могут сделать гидрофильные поверхности гидрофобными и наоборот (27). Смачиваемость поверхности твердого тела может быть оценена по распространению капель воды на ней и путем измерения их углов контакта. Контактный угол равный 0 ° представляет полное смачивание. Гидрофильная (смачиваемая) сторона гидрофобиновой пленки варьируется от умеренной до высоко гидрофильной (углы контакта с водой от 22 до 64 °). Гидрофобные стороны большинства гидрофобиновых пленок, образованных на гидрофильном твердом теле, водоотталкивающие.

Гидрофобная сторона гидрофобиновых пленок класса I имеют характерный рисунок из палочек (10,32,38). Было показано, что очищенные гидрофобины класса I формируют шаблонные палочковые пленки in vitro. Палочки наблюдались, когда каплю водного раствора гидрофобинов класса I высушили на твердой подложке (6,25,32,39,40,41). Диаметр этих гидрофобиновых палочек составляет около 10 нм. Длина палочек, как правило, составляет сотни нанометров (38,42). Палочковый слой был также виден на воздушных пузырьках, покрытых гидрофобином SC3 (4,43,44).

Никаких палочек не наблюдалось при анализе пленок, образованных очищенными гидрофобинами класса II, такими как CRP (46), CU (51) и CFTH1 (52).

При исследовании самоорганизации SC3 непосредственно на границе воздух-вода было выявлено, что дисульфидные мостики не принимают непосредственного участия в процессе сборки (45). SC3 быстро накапливается на границе раздела воздух-вода и подвергается конформационному переходу из смеси элементов вторичной структуры, в основном, в форму b-листов. Анализы показывают, что b-листы в палочках SC3 параллельны поверхности, а следовательно, также компланарны с длинной осью палочек. Исследования олигомеризации SC3 показывают, что накопление гидрофобина на границе до критической концентрации необходимо для того, чтобы позволить палочкам сформироваться и что преобразование в b-форму имеет место на границе раздела.

Гидрофобины класса II HFBI и HFBII не претерпевают конформационные изменения, наблюдаемые в SC3, когда они собираются на границе воздух-вода (57,58).

Гидрофобины весьма поверхностно-активные молекулы, самоорганизуются в высокоорганизованные монослойные структуры, в соответствии с рисунком 7, на котором функции гидрофобинов на границах раздела и в растворе суммированы. Специфические межмолекулярные взаимодействия в монослое приводят к появлению связующей пленки, которую можно наблюдать, как формирование из плоской пленки. Необычная амфифильная структура приводит к уникальным свойствам на границах раздела фаз и в растворе. Как и при формировании мицелл детергентов, гидрофобины, в растворах, формируют мультимеры в которых гидрофобные взаимодействия являются значительными.

Гидрофобины являются поверхностно-активными, адсорбируются на границах раздела фаз, и ассоциируются в растворе в мультимеры (59).

Рисунок 7 — функции гидрофобинов на границах раздела фаз и в растворе

1.1.5 Пенообразующие и пеностабилизирующие свойства гидрофобинов

Жидкие пены термодинамически нестабильны и, со временем, в конечном счёте, укрупняются и рассеиваются. Жидкие пищевые пены в основном делятся на две категории: те, которые создаются и потребляются в течение короткого промежутка времени, так что длительная стабильность пены не является важной характеристикой (примеры включают молочные коктейли, капучино и пиво); или те, где реология продолжительной фазы увеличивается до такой степени, что пена становится кинетически захваченной и эффективно стабилизируется до конца существенного периода. Примеры такого применения включают продукты, где объёмная фаза желирована, такие как муссы или лёгкий воздушный сыр, или частично кристаллизована, например мороженое или взбитое масло. Производители пищевых продуктов давно хотят иметь возможность производить стабильные жидкие пены без гелевой или затвердевшей фазы, но пока это не было реализовано на практике. Если эта проблема будет решена, то ряд типов продуктов, которые производитель способен аэрировать стабильным способом, расширится. Будут существовать значительные возможности для улучшения функциональности продукта, создания новые текстур, или уменьшения плотности калорийности на единицу объёма путём вспенивания.

Устойчивость пены вспененных растворов, содержащих белок гидрофобин II класса HFBII из Trichoderma ressei [13], была изучена и сравнена с устойчивостью других типичных пищевых эмульгаторов и вспенивающих агентов. Обнаружено, что в простых растворах 0,1% HFBII образует исключительно устойчивые пены при широком ряде рН-состояний раствора. Во вспененных растворах, содержащих ксантановый загуститель с целью понизить скорость кремообразования, продемонстрировано, что пены, стабилизированные HFBII, не показали значительного изменения в размере пузырьков или объема воздушной фазы в течение периода, не менее 4-х месяцев. Такая устойчивость пены значительно больше, чем у любых пищевых вспенивающих агентов, известных нам в настоящее время. HFBII стабилизирует пены исключительно путём адсорбции к поверхности раздела воздух-вода, формируя высоко упругую поверхность и обеспечивая стойкость как к слипанию, так и к диспропорционированию, не влияя на вязкость водной фазы.

Полученные в результате опытов данные показывают потенциал гидрофобинов образовывать стабильные пузырьки и пены только путём поверхностной адсорбции. Способность стабилизировать пену путём поверхностной адсорбции, в отличие от стабилизации через объёмную фазу, может обеспечить реальную возможность производить вспененные продукты со стабильной пеной.

Было исследовано применение гидрофобинов для пен как в модельных системах, так и в образцах пищевых продуктов, а также сравнение их с некоторыми другими типичными пищевыми эмульгаторами и пенообразователями.

1.2 Pleurotus ostreatus

Во время исследований проводилось получение биомассы и культуральной жидкости базидиального гриба Pleurotus ostreatus. Pleurotus ostreatus или вешенка обыкновенная относится к отделу Базидиомицеты, порядку Агариковые, семейству Плевротовые (Вёшенковые).

Дереворазрушающий гриб-сапрофит (ксилофит), широко распространённый в лесах умеренной зоны. Растёт группами, реже — одиночно, на пнях, валежнике, сухостойных или живых, но ослабленных, деревьях различных лиственных (дуб, берёза, рябина, осина, ива), очень редко — на хвойных, пород в лиственных и смешанных лесах, парках и садах. На древесных стволах встречается довольно высоко над землей. Часто растёт густыми пучками из 30 и более плодовых тел, срастающимся у основания, и образует «многоярусные конструкции».

Встречается с сентября по ноябрь-декабрь (массовое плодоношение — в конце сентября-октябре), хорошо переносит отрицательные температуры. При благоприятных условиях (холодная погода) может появляться и в мае-июне.

Вёшенка обыкновенная вызывает жёлтую смешанную гниль стволов деревьев лиственных, реже хвойных пород. Заражение обычно происходит через морозобойные трещины. Плодовые тела грибов образуются в месте наибольшего развития гнили. Гриб продолжает развиваться и на мёртвой древесине.

Вёшенка обыкновенная относится к т. н. хищным грибам и способна парализовывать с помощью выделяемого нематотоксина и переваривать нематод, таким образом получая азот.

Pleurotus ostreatus является коммерчески важным съедобным грибом широко известным как вешенка. Этот гриб является промышленно-производимым как человеческая пища, и на его долю приходится почти четверть мирового производства грибов (90). Он также используется для биоконверсии сельскохозяйственных, промышленных и лигноцеллюлозных отходов (91,92), как источник ферментов и других химических веществ для промышленных и медицинских приложений (использований) (93,94,95), в качестве агента для биоремедиации (96), и в качестве органического удобрения (97).

1.3 Coprinus lagopides

Во время исследований проводилось получение биомассы базидиального гриба Coprinus lagopides. Навозник, или Копринус (лат. Coprinus) — род грибов семейства Шампиньоновые (Agaricaceae). Сапротрофы, растут на субстратах, богатых питательными веществами: на кучах навоза (копрофильные грибы), перегноя, на плодородной, богатой гумусом почве, гниющей древесине и растительных остатках.

Навозник волосистоногий (лат. Coprinopsis lagopidus) — гриб из рода Coprinopsis.

Шляпка:

Веретеновидно-эллиптическая у молодых грибов, по мере взросления (в течение суток, не дольше) раскрывается до колокольчатой, затем до почти плоской с завернутыми наверх краями; автолиз, саморастворение шляпки, начинается еще на колокольчатой стадии, так что до «плокой» стадии доживает обыкновенно лишь центральная ее часть. Диаметр шляпки (на веретенообразной стадии) составляет 1−2 см, высота — 2−4 см. Поверхность густо покрыта остатками общего покрывала — мелкими белыми хлопьями, похожими на ворс; в редких промежутках проглядывает оливково-бурая поверхность. Мякоть шляпки очень тонкая, хрупкая, быстро разлагается от пластинок.

Пластинки:

Частые, узкие, свободные, в первые несколько часов светло-серые, затем темнеют до черных, превращаясь в чернильную слизь.

Споровый порошок:

Фиолетово-черный.

Ножка:

Высота 5−8 см, толщина до 0,5 мм, цилиндрическая, нередко изогнутая, белая, покрытая светлыми чешуйками.

Распространение:

Навозник волосистоногий порой встречается «летом и осенью» (сроки плодоношения необходимо уточнить) в самых разных местах на хорошо прогнивших останках лиственных деревьев, а иногда, очевидно, и на богато унавоженной почве. Плодовые тела гриба развиваются и ичезают очень быстро, узнаваем Coprinus lagopidus бывает лишь в первые часы жизни, так что ясность в вопросах распространения гриба наступит еще не скоро.

Съедобность: Описывается как несъедобный.

2 Цели и задачи работы

Цель:

— исследовать грибы Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides в качестве возможных продуцентов гидрофобинов.

Задачи:

— отработать методику получения поверхностно-активных белков из грибного мицелия, культуральной жидкости, плодовых тел культуры Pleurotus ostreatus;

— оценить культуру Coprinus lagopides в качестве возможного продуцента поверхностно-активных белков;

— оценить влияние полученных белков на пенообразование и стабильность пены;

3 Экспериментальная часть

3.1 Объекты исследования

Объектами исследований являлись высшие базидиальные грибы из коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides.

3.2 Общий ход работы

Для получения необходимого для исследования материала осуществлялось выращивание грибов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides методом глубинного культивирования. Биомассу отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, сушили и определяли ее влажность и вес. Экстракцию гидрофобинов проводили из влажной биомассы Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides, а также из плодовых тел Pleurotus ostreatus. В экстрактах определяли концентрацию белка. Часть экстрактов разделяли с помощью ВЭЖХ и проводили электрофорез. Затем проводили выпаривание на вакуум-выпарной установке с целью получения белкового препарата без этанола, который является пеногасителем и оценивали влияние мицелиальных экстрактов Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides на пенообразование и стабильность пены. Нативный раствор культуральной жидкости гриба Pleurotus ostreatus также исследовали на наличие поверхностно-активных белков.

3.3 Материалы и методы исследования

3.3.1 Глубинное культивирование гриба

При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объеме жидкой питательной среды. В микроорганизмах протекают два связанных процесса — синтез биомассы и синтез белков. Продолжительность ростового цикла зависит от условий культивирования, исходной плотности, возраста инокулюма, состава и объема питательной среды, видоспецифичности исходной культуры. [4]

Исходные культуры грибов выращивали в пробирках на скошенном сусло-агаре при температуре 22−24?C в течение 7−10 суток — до полного зарастания поверхности косяка. Выросшую культуру хранили в холодильнике при температуре +4?C.

Сусло-агар готовили следующим образом: Вначале приготовили сусло из солодовых ростков для чего брали 400 г ростков на 2 л воды, доводили до 50? C и настаивали при данной температуре в течение 20−25 мин. Далее нагревали до 60? C и настаивали 20−25 мин. Нагревали до 70? C и настаивали. Снова доводили температуру до 80? C и настаивали, после чего оставляли остыть. Фильтровали через вакуум-фильтр. После к готовому суслу добавляли 2% агара и смесь нагревали до расплавления агара. Затем разливали в пробирки и стерилизовали.

Посевной материал для глубинного процесса выращивали в два этапа. На первом этапе культуру гриба выращивали в пробирках на сусло-агаре при температуре 22−24°C в течение 7−10 суток. На следующем этапе 2−3 кусочка мицелия пересевали с агаризованной среды в конические колбы объёмом 0,5 л со 150 мл среды. На дно колб засыпали стеклянные или керамические бусы диаметром 7−10 мм. Посевной материал выращивали в стационарных условиях при температуре 22−24?C в течение 7−10 суток до полного зарастания поверхности плёнкой мицелия.

Выращенный поверхностным способом посевной материал измельчали с помощью бус. Полученную суспензию использовали в качестве посевного материала для стадии глубинного культивирования. Посевной материал вносили при помощи градуированной пипетки на 10 мл.

Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл со 100 мл среды на роторной качалке (230 об/мин) при температуре 28−30°C в течение 7 суток.

В качестве среды для получения посевного материала и при глубинном культивировании Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides использовали полусинтетическую питательную среду.

Состав питательной среды представлен в таблице 1.

Таблица 1 — Состав питательной среды

Стерилизацию сред проводили при 0,5*105 Па в течение 40 минут.

Стерилизацию посуды проводили при 1,3*105 Па в течение 90 минут.

3.3.2 Отделение биомассы продуцента

Нативный раствор отделяли от мицелия грибов фильтрованием через бумажный фильтр под вакуумом. Биомассу сушили в сушильном шкафу при температуре 50єС. Количество сухой биомассы определяли весовым методом. После чего определяли суточный прирост биомассы при глубинном культивировании каждой из культур. Данный метод позволил определить продуцента с наибольшим выходом биомассы, а также сутки, на которые прирост биомассы был максимальным.

3.3.3 Определение влажности биомассы

Влажность биомассы является важной характеристикой, так как необходима для расчета количества выделенного белка на 1 г сухого вещества, а также для учета разбавления раствора при экстракции.

Абсолютной влажностью называют отношение массы влаги к массе сухой биомассы. Влажность расчитывали по формуле:

Wa = ((m — m0)/m0)*100% (1)

где Wa — абсолютная влажность, %;

m — масса образца во влажном состоянии, г;

m0 — масса того же образца, высушенного до постоянного значения, г.

3.3.4 Выделение гидрофобинов

В настоящее время в литературных источниках содержится крайне мало информации о способах экстракции гидрофобинов. Количества очищенных гидрофобинов сообщались очень редко, вероятно, это связано с количественной проблемой. Очистка гидрофобинов I класса, как правило, основывается на низкой растворимости их агрегатов в этаноле или горячем разбавленном SDS.

В соответствии с немногочисленными источниками был выбран следующий метод выделения поверхностно-активных белков из биомассы высших грибов: для очистки гидрофобинов из клеточных стенок Pleurotus ostreatus и Coprinus lagopides, примеси были удалены с помощью горячего 1% SDS с последующим высвобождением поверхностно-активных белков с помощью ТФУ (1,4,66,67). Из культуральной жидкости гидрофобины выделили путем вспенивания среды, растворением в ТФУ и удалением кислоты выпариванием (4).

Экстракцию проводили в колбах Эрленмейера объёмом 700 мл. На 350 мл экстрагента брали 100 г биомассы.

3.3.4.1 Выделение гидрофобинов из культуры гриба

Pleurotus ostreatus

Вначале было проведено исследование гриба Pleurotus ostreatus как возможного продуцента поверхностно-активных белков — гидрофобинов. Для достижения данной цели провели экстракцию гидрофобинов из полученной глубинным культивированием биомассы и из готовых плодовых тел. Также поверхностно-активные белки были выделены из нативного раствора культуральной жидкости данного гриба. После чего сравнивали количества полученных поверхностно-активных белков для определения наиболее эффективного и подходящего материала для выделения гидрофобинов.

3.3.4.1.1 Экстракция гидрофобинов из биомассы

Гидрофобины из мицелия Pleurotus ostreatus выделили, используя их свойства: они нерастворимы в кипящем растворе трис-HCl буфера, содержащем 1% SDS и при рН 9 в течение 15 минут.

После этой операции нерастворимые гидрофобины были отделены от других растворимых белков путём центрифугирования при 4100 x g в течение 10 минут при 4оС и несколькими смываниями водой. Далее осадок высушивали в сушильном шкафу при температуре 50оС, обрабатывали 50 мл трифторуксусной кислоты (99%) в течение 2 ч., после чего выпаривали ТФУ на вакуум-выпарной установке. Из полученного высушенного осадка поверхностно-активные белки экстрагировали 60% этиловым спиртом. Для чего брали 100 мл 60% этилового спирта и экстрагировали 15 минут периодически помешивая. Затем отделяли осадок от супернатанта центрифугированием при 4100 х g, 10 минут при 4оС. В экстрактах определяли содержание белка. Часть полученных экстрактов отправляли в ИВС для проведения ВЭЖХ, а также проводился электрофорез для определения молекулярной массы полученных белков.

3.3.4.1.2 Экстракция гидрофобинов из плодовых тел

Так как содержание поверхностно-активных белков в биомассе гриба Pleurotus ostreatus оказалось довольно низким, проводилось исследование на наличие гидрофобинов в плодовых телах данной культуры.

Экстракцию проводили отдельно из шляпок и ножек плодовых тел Pleurotus ostreatus. Измельченные плодовые тела выдерживали в кипящем растворе трис-HCl буфера, содержащем 1% SDS, после чего гидрофобины были отделены от других растворимых белков путём центрифугирования при 4100 x g в течение 10 минут при 4оС и несколькими смываниями водой. Далее экстракцию проводили в соответствии с методикой, описанной для выделения поверхностно-активных белков из биомассы.

3.3.4.1.3 Выделение гидрофобинов из нативного раствора

Также, в соответствии с литературными данными, на наличие гидрофобинов была исследована культуральная жидкость гриба Pleurotus ostreatus. Выделение поверхностно-активных белков из нативного раствора проводилось следующим образом: после 7 дней выращивания гриба гидрофобины, выделившиеся в среду, были агрегированы путём вспенивания нативного раствора культуральной жидкости с использованием аэратора. Затем пена была собрана и отцентрифугированна при 4100 x g в течение 10 минут при 4оС. Получившийся осадок подвергали сушке в сушильном шкафу при температуре 50оС. Далее осадок был обработан трифторуксусной кислотой в течение 2-х часов. После кислоту выпаривали на вакуум-выпарной установке и из полученного сухого осадка белки экстрагировали 60% этиловым спиртом и центрифугировали при 4000 x g, 10 мин, 4оС. Супернатант был использован для дальнейших анализов, в том числе для разделения в ВЭЖХ.

3.3.4.2 Выделение гидрофобинов из культуры гриба

Coprinus lagopides

В результате исследований выяснилось, что гриб Pleurotus ostreatus продуцирует не большое количество поверхностно-активных белков, но при этом наиболее предпочтительным материалом для выделения гидрофобинов является биомасса гриба, полученная глубинным культивированием. В связи с этим проводилось выделение гидрофобинов из биомассы гриба Coprinus lagopides. Экстракция проводилась двумя способами: с обработкой концентрированным спиртом на промежуточном этапе и без обработки, в соответствии с методикой, описанной для выделения гидрофобинов из мицелия Pleurotus ostreatus.

3.3.4.2.1 Экстракция гидрофобинов из биомассы с промежуточной обработкой спиртом

Нерастворимые в кипящем растворе трис-HCl буфера, содержащем 1% SDS, гидрофобины были отделены от других растворимых белков путём центрифугирования при 4100 x g в течение 10 минут при 4оС и несколькими смываниями водой. Далее осадок высушивали в сушильном шкафу при температуре 50оС. Полученный осадок был проэкстрагирован 150 мл этанола (96%) при нагревании в течение 10 мин с целью удалить нековалентно связанные липиды (4). Осадок отделяли центрифугированием при 4100 х g в течение 10 мин при 4оС, обрабатывали ТФУ в течение 2 часов. Дальнейшее выделение гидрофобинов проводилось в соответствии с методикой, описанной ранее. Полученные экстракты также были отправлены в ИВС для разделения при помощи ВЭЖХ.

3.3.4.2.2 Экстракция гидрофобинов из биомассы без промежуточной обработки спиртом

Экстракция из биомассы гриба Coprinus lagopides проводилась в соответствии с методикой, описанной ранее для гриба Pleurotus ostreatus. Полученный в результате экстракции спиртовой раствор, содержащий поверхностно-активные белки, был также разделен с помощью ВЭЖХ.

3.3.5 Определение количества белка

Определение белка в полученных экстрактах осуществляли по методу Бредфорда.

Метод основан на реакции красителя Кумасси (Coomassie Brilliant Blue G-250) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе.

Метод дает хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя: чем больше красителя, тем чувствительней метод), менее «капризный» по сравнению с методом Лоури.

Реактивы:

Реактив Кумасси. 10 мг красителя (G — 250) гомогенизируют в 5 мл 95%-ного спирта (на магнитной мешалке). Полученный раствор смешивают с 10 мл 85%-ной фосфорной кислоты, доводят объем водой до 100 мл (в мерной колбе). Реактив отфильтровывают.

Ход определения:

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01—0,10 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорд, перемешивают и оставляют при комнатной температуре в течение одинакового времени в интервале от 2 до 60 мин. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата. Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 595 нм в соответствии с рисунком 8.

Рисунок 8 — Калибровочный график для определения белка по методу Бредфорда

3.3.6 Разделение экстрактов методом ВЭЖХ

Жидкостная хроматография — метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой является жидкость.

Подвижная фаза в жидкостной хроматографии выполняет двоякую функцию:

1) обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке;

2) регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание в результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ.

В ЖХ природа подвижной фазы имеет существенно большее значение. В результате комбинации ограниченного числа сорбентов и неограниченного числа, различных по составу, подвижных фаз возможно решение чрезвычайно большого числа встречающихся на практике задач.

ЖХ подразделяется на варианты в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий:

— в ситовой хроматографии разделение компонентов осуществляется за счет разницы в растворимости молекул при их прохождении (фильтрации) через слой сорбента;

— в адсорбционной хроматографии — за счет разницы в адсорбируемости молекул, проходящих через слой частиц сорбента, покрытых неподвижной фазой в виде тонкого слоя или поверхностнопривитых радикальных групп;

— в ионообменной и ионной хроматографии — за счет разницы в способности к обмену ионами с ионообменниками;

3.3.6.1 Молекулярная адсорбционная хроматография

В зависимости от природы подвижной (ПФ) и неподвижной (НФ) фазы различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. В нормально-фазовой ВЭЖХ НФ — полярная (чаще всего силикагель), а ПФ — неполярная (гексан, либо смеси гексана с более полярными органическими растворителями). Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. Разделения компонентов достигают, меняя элюрующую силу подвижной фазы.

Так как в данной работе исследуются поверхностно-активные белки, то для разделения была использована обращенно-фазовая ВЭЖХ.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза — неполярная — гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18. В зависимости от способа обработки свойства гидрофобизированных силикагелей могут изменяться, поэтому свойства коммерческих колонок различных фирм несколько отличаются. Содержание углерода составляет 5−20%. Степень покрытия поверхности силикагеля органическим модификатором составляет 10−60%, в лучших случаях она достигает 90%; ПФ — полярная — смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др. Меняя состав подвижной фазы в ОФЖХ, можно изменять удерживание в очень широких пределах. Чтобы добиться приемлемого времени удерживания, обычно необходимо использовать смеси воды с органическим растворителем — так называемым модификатором. Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Наименьшей элюирующей способностью обладает вода, а для повышения элюирующей способности в ПФ вводят ацетонитрил, метанол и другие растворители. Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.