После этого из культуры взяли каплю материала. Петлю вынесли из пробирки, пробирку закрыли в пламени спиртовки и поместили в штатив.
Взятый из культуры материал нанесли на обезжиренное предметное стекло и распределили по нему. Обезжиривание стекла производили непосредственно перед работой. Для этого участок стекла, на который впоследствии был нанесён препарат, обработали мылом и протерли марлей. Для полного обезжиривания можно так же прожигать стёкла в пламени горелки. После нанесения препарата на стекло оставшиеся на микробиологической петле организмы были уничтожены. Это было произведено путём однократной стерилизации петли в пламени спиртовки.
2.
2.Окраска эндоспор
2.
2.1. Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста Раствор карболового фуксина Для приготовления 1 г основного фуксина растворить в 2 мл глицерина и долить до 100 мл 5% раствором фенола.
Так же можно применить следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.
2,5% раствор серной кислоты
96° раствор этилового спирта Раствор метиленового синего Вода Термостат 37 °C Ход работы:
Был приготовлен мазок препарата, как описано выше.
На мазок было нанесено несколько капель раствора карболового фуксина (можно использовать фуксин на анилиновой воде), окрашивание проводилось в термостате при 37 °C в закрытой посуде в течение нескольких часов.
Препарат обесцвечивали 2,5% раствором серной кислоты в течение 3 — 5 с и сполоснули 96% спиртом, до тех пор, пока в раствор не перестали переходить облачка красителя.
Препарат был докрашен метиленовым синим в течение 3 — 5 мин.
После докрашивания препарат ополоснули в проточной воде и высушили на воздухе. Микроскопию проводили при масляной иммерсии.
Возможна модификация процесса на стадии окрашивания фуксином, позволяющая ускорить процесс приготовления препарата. В этом случае окрашивание производится только карболовым фуксином. Мазок, покрытый красителем, следует подогревать на огне до появления паров в течение 5 — 8 мин. При использовании данного подхода обесцвечивание проводится 10 — 20 секунд в 2,5% серной кислоте.
Результат окрашивания:
Эндоспоры окрасились в красный цвет, бактерии — в синий.
2.
2.2. Окрашивание эндоспор по методу Меллера Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
5% водный раствор хромовой кислоты Раствор карболового фуксина
5% раствор серной кислоты Раствор метиленового синего Вода Газовая горелка Ход работы:
Зафиксированные мазки были помещены на 2 минуты в хлороформ.
Обработанные таким образом мазки были перенесены в 5% водный раствор хромовой кислоты на 2 — 10 минуты.
Препарат был промыт в проточной воде и окрасить карболовым фуксином. Для этого на стекло нанесли несколько капель красителя. Окрашивание проводили в течение 1 минуты (стекло при этом подогревали на горелке до появления паров).
Препарат был обесцвечен в 5% растворе серной кислоте в течение 5 с.
Препарат тщательно промыли в проточной воде и подкрасили водным раствором метиленового синего в течение 3 минут.
Препарат промыли в проточной воде ещё раз и высушли на воздухе Микроскопию препарата проводили при масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Эндоспоры приобрели красный цвет, вегетативные клетки бактерий окрасились в синий.
2.
2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
1% водный раствор сафранина
5% раствор малахитового зелёного Вода Спиртовка Ход работы:
Мазки культуры были зафиксированы над огнем.
Препарат был окрашен 5% водным раствором малахитового зеленого в течение 5—10 мин.
Препарат промывали в проточной воде.
Было произведено докрашивание препарата 1% водным раствором сафранина в течение 30 с.
Стекло промыли водой, и высушили на воздухе Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Эндоспоры окрасились в зелёный цвет, клетки бактерий — в красный (препарат окрашенный по этой методике представлен на рис 3).
Рисунок 3. Bacillus subtillus, окраска по Шефферу-Фултону
2.
2.4. Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески) Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
0,5% раствор соляной кислоты Фильтровальная бумага Раствор карболового фуксина
1% солянокислый спирт Метиленовым синий Лефлера Вода Спиртовка Ход работы:
Для работы был приготовлен мазок культуры. Для дальнейшей работы использовался нефиксированный мазок.
На мазок налили 0,5% раствор соляной кислоты и подогрели стекло над огнем 1 — 2 минуты. Затем слили с препарата кислоту и тщательно промыть проточной водой, высушить на воздухе.
После высыхания мазок был зафиксирован в пламени. Фиксированный препарат окрашивали по методу Циля — Нильсена, описанному ниже.
Этот метод применяется для окраски кислотоустойчивых бактерий, в том числе микобактерий туберкулёза.
Налили на фиксированный мазок карболового фуксина (окрашивание производилось через фильтровальную бумагу) и подогрели стекло над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживали в течение 1—2 минут, не доводя до кипения.
Слили краску со стекла, удалили фильтровальную бумагу и тщательно промыли препарат в водопроводной воде.
Обесцветили препарат 1% солянокислым спиртом (раствором соляной кислоты в 70° спирте) до тех пор, пока мазок не принял бледно-розовый тон (примерно 30—60 секунд).
Препарат промывали в воде 15−30 секунд.
Докрашивание препарата производили метиленовым синим Лефлера 15−30 секунд. Затем мазки ополоснули 70° спиртом.
Сполоснули препарат в воде и высушили фильтровальной бумагой.
Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры — синюю.
2.
2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
2. 10% формалин
3. Аммиачный метиленовый синий
4. 0,5% раствор сафранина
5. Вода
6. Спиртовка Ход работы:
Нефиксированный мазок обработали 10% формалином в течение 10 мин. 2. Мазок был промыт в проточной водой и высушен на воздухе.
Препарат был окрашен аммиачным метиленовым синим в течение 3 минут (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего + 3 мл 98% раствора аммиака + 80 мл дистиллированной воды), при этом стекло нагревали над огнем до закипания красителя.
Промыли мазок проточной водой.
Докрашивание проводили 0,5% раствором сафранина 3—5 минут, затем промыли водой, высушили на воздухе Препарат изучали под микроскопом при масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры — синюю.
2.
3.Окраска экзоспор по Шеффер-Фултону Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры актиномицетов в стационарной фазе роста
1% водный раствор сафранина
5% раствор малахитового зелёного Вода Спиртовка Ход работы:
Мазки культуры были зафиксированы над огнем.
Препарат окрашивали 5% водным раствором малахитового зеленого в течение 5—10 мин.
Промывали препарат в проточной воде.
Докрашивание препарата проводили 1% водным раствором сафранина в течение 30 с.
Промывали водой, и высушивали на воздухе Препарат был изучен под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Экзоспоры окрасились в зелёный цвет, вегетативные клетки бактерий — в красный.
Выводы Существует ряд методов, позволяющих подтвердить наличие спор в исследуемом материале путём окрашивания и последующей световой микроскопии.
Для окрашивания эндоспор применяются следующие методы: метод Вайсера — Хьюппе, метод Меллера, метод Шеффера — Фултона, метод Ожешки и метод Битгера.
Метод окраски по Шеффер-Фултону подходит как для выявления эндоспор, так и экзоспор.
Для визуализации спор могут быть использованы разные красители.
Основная проблема при окрашивании спор бактерий заключается в создании условий для связывания их со спорой, что обусловлено присущей ей высокой кислотоустойчивостью.
Процесс окрашивания спор бактерий является более сложным и многоэтапным процессом по сравнению с окраской вегетативных клеток.
Список литературы
Борисов
Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — 736 с.
Верещагин Н.Н., Смирнова О. А., Плотникова О. А., Коваленко Е.В.// Мат-лы IX съезда Всероссийского научно-практич. общества эпиде-миологов, микробиологов и паразитологов. Москва. — 2007. — Т.
3.- С. 93.
Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А. И., Рачковская И. В., Каплич В. М. М.: Колос. — 2001. — 538 с.
Ветеринарное законодательство. Т. 2, 3, 4. Под ред. А. Д. Третьякова. М.: Колос. — 1972
Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М. В., Минеева Л. А. — 3-е издание. -М: Академия. — 2007. — 464 с.
Кадымов Р.А., Мамедов И. Б., Джульфаев С. А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. — 1990. — 499 с.
Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н. М., Госманов Р. Г. — М.: Колосс.- 2006. — 432 с.
Кузьмин В.А., Святковский А. В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. — 2005. — 429 с.
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А. А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004. 691 с.
Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е. Н. Кондратьева, пер .с нем. Л. В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — 566 с.
Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса, пер.
с англ. под ред. Г. А. Заварзина. — М: Мир.
— 1997 — в 2.т.
Справочник ветеринарного врача. Под ред. В. Г. Гавриша и И. И. Калюжного. — РостовнаДону: Феникс. — 1999 — 608с.
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А. А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004. с. 425
Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М. В., Минеева Л. А. — 3-е издание. -М: Академия. — 2007. — с. 137
Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е. Н. Кондратьева, пер .с нем. Л. В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — с. 204
Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — с. 422
Кузьмин В.А., Святковский А. В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. — 2005. — с. 232
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А. А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004. с. 424
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А. А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. — 2004. с. 428
Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е. Н. Кондратьева, пер .с нем. Л. В. Алексеевой. — М: Мир. — 1987. — с. 312
Кадымов Р.А., Мамедов И. Б., Джульфаев С. А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. — 1990. — с. 314
Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С.
Уилльямса, пер. с англ. под ред. Г. А. Заварзина. — М: Мир.
— 1997 — т.
1. — с. 267
Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А. И., Рачковская И. В., Каплич В. М. М.: Колос. — 2001. — с. 346
Верещагин Н.Н., Смирнова О. А., Плотникова О. А., Коваленко Е.В.// Мат-лы IX съезда Всероссийского научно-практич. общества эпиде-миологов, микробиологов и паразитологов. Москва. — 2007. — Т.
3.- с. 93.
Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. — 2001. — с. 437
Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н. М., Госманов Р. Г. — М.: Колосс.- 2006. — с. 254
Ветеринарное законодательство. Под ред. А. Д. Третьякова. М.: Колос. — 1972. — т.
2. — с. 412
