Лабораторная диагностика цитокинов в норме и патологии

КУРСОВАЯ РАБОТА Лабораторная диагностика цитокинов в норме и патологии

С момента описания первых цитокинов прошло немного времени. Однако их исследование привело к выделению обширного раздела знаний — цитокинологии, являющейся неотъемлемой частью различных областей знания и, в первую очередь, иммунологии, давшей мощнейший толчок к изучению этих медиаторов. Цитокинология пронизывает все клинические дисциплины, начиная от этиологии и патогенеза заболеваний и заканчивая профилактикой и лечением различных патологических состояний. Научным исследователям и клиницистам необходимо ориентироваться в разнообразии регуляторных молекул и иметь ясное представление о роли каждого из цитокинов в изучаемых процессах.

Цитокины могут быть маркерами заболеваний иммунной системы, так как:

· синтез цитокинов сопровождает главные процессы развития защитных реакций;

· многие цитокины и их рецепторы индуцибельны, по их появлению в клетках можно оценить активацию иммунитета;

· большинство цитокинов являются растворимыми циркулирующими медиаторами, и их концентрацию легко определить в плазме крови и других биологических жидкостях.

Все эти пункты указывают на значимость определения уровня цитокинов при диагностике заболеваний, и этим сейчас активно пользуются практикующие врачи.

Целью данной работы является рассмотрение вопроса о способах диагностирования, методах оценки функционирования системы цитокинов на примере трех провоспалительных (IL-1RA, IL-1 В, TNFб) и одного противовоспалительного цитокина (IL-10), как изменяется их концентрация в патогенезе некоторых заболеваний человека, а также роль наследственных нарушений регуляции цитокинов в этих заболеваниях.

1. Общие представления о цитокинах

Цитокины — это продуцируемые клетками белково-пептидные факторы, осуществляющие короткодистантную регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий. Цитокины определяют выживаемость клеток, стимуляцию или ингибирование их роста, дифференцировку, функциональную активацию и апоптоз клеток. Способность регулировать перечисленные функции обусловлена тем, что после взаимодействия цитокинов с комплементарными рецепторами на поверхности клеток, сигнал через элементы внутриклеточной трансдукции передается в ядро, где активируются соответствующие гены. Белки, продукты активированных цитокинами генов, продуцируются клетками и регулируют перечисленные выше процессы [2].

Для цитокинов характерны следующие общие свойства:

· цитокины — это как бы «эсперанто» в межклеточном общении. Одноименные цитокины продуцируются клетками разной тканевой дифференцировки. И рецепторы для одноименных цитокинов экспрессированы на клетках различной тканевой дифференцировки. Таким образом клетки разных тканей «говорят» друг с другом и «могут быть услышаны» друг другом. Именно посредством цитокинов в первую очередь система лимфоцитарного иммунитета сращена с другими биологическими системами резистентности к инфекциям и со всем организмом в целом;

· цитокины в подавляющем большинстве случаев — это близкодействующие медиаторы локальных взаимодействии клеток в очагах тех или иных процессов в тканях, даже пары клеток. В зависимости от известных параметров иррадиации эффектов цитокинов выделяют аутокринные эффекты, паракринные эффекты и эндокринные эффекты (выявлены только для 4 цитокинов (TNFб, IL-1, ИЛ-6, М-CSF) и не у здоровых организмов, а при тяжелой системной патологии типа септического шока);

· цитокины не депонируются в клетках, а синтезируются импульсно «по запросу», начиная с транскрипции мРНК цитокина с соответствующего гена. Единственное известное исключение — депонирование небольших количеств TNFб в гранулах тучных клеток;

· матричная РНК цитокинов короткоживущая, что объясняет транзиторный характер их продукции клеткой, они вырабатываются вскоре после получения «запроса» на их продукцию и недолго;

· для цитокинов характерна взаимосвязь друг с другом по типу «салочек» или «передай другому»: воздействие одного цитокина на клетку вызывает выработку этой клеткой других цитокинов. Это явление называют цитокиновым каскадом [1].

1.1 IL-1RA

цитокин биологический экспрессия полиморфизм Антагонист рецептора IL-1 (IL-1RA) является мономерным гликозилированным белком с молекулярной массой 25 kDa, который продуцируется моноцитами, макрофагами, нейтрофилами и гепатоцитами. Он связывается с одним из рецепторов для IL-1 — С121а, но не вызывает активационных эффектов в клетке-мишени. Таким образом, IL-1RA выступает в качестве ингибитора и, по-видимому, является важным физиологическим регулятором экспрессии IL-1. Недавно проведенные исследования показали, что in vivo баланс между IL-1 и IL-1Ra играет важную роль в защите организма от инфекции и ограничении дальнейшего повреждения пораженных тканей. Для инфекционных заболеваний максимальное повышение уровня IL-1RA наблюдается при сепсисе. При этом повышенные концентрации IL-1RA коррелируют с благоприятным прогнозом. Недостаточная продукция IL-1RA значительно ухудшает тяжесть поражения тканей при болезни Лайма, туберкулезе, саркоидозе. Другие исследования показали значимость IL-1RA как эндогенного противовоспалительного агента при ишемических поражениях головного мозга, воспалительных заболеваниях кишечника, респираторном дистресс-синдроме, бронхиальной астме, пиелонефрите. IL-1RA присутствует в высоких концентрациях в амниотической жидкости в третьем триместре, в моче больных с лихорадкой, в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. В настоящее время проводятся клинические испытания фармакологических препаратов на основе рекомбинантного IL-1RA [14].

1.2 IL-1в

Интерлейкин 1 В является преобладающей формой IL-1. Это многофункциональный цитокин с широким спектром действия, играет ключевую роль в развитии и регуляции неспецифической защиты и специфического иммунитета, один из первых включается в ответную защитную реакцию организма при действии патогенных факторов. Основными продуцентами IL-1 В являются макрофаги и моноциты. В синтезе данного цитокина также могут принимать участие лимфоциты, фибробласты. Клетки-мишени — иммунокомпетентные, эндотелиальные, эпителиальные клетки, фибробласты и др. IL-1 В инициирует и регулирует воспалительные, иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Ти В-лимфоциты, стимулирует синтез белков острой фазы, цитокинов (IL — 2,3,6, TNFб), молекул адгезии (Е-селектинов), прокоагулянтов, простагландинов. IL-1 В повышает хемотаксис, фагоцитоз, гемопоэз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность, оказывает пирогенный эффект и др.

IL-1 В принадлежит существенная роль в патогенезе СПИДа. При псориазе синтез IL-1 В не снижается, но падает их функциональная активность. IL-1 В подавляет развитие В-лимфоцитов, участвует в выборе направления гемопоэза между миелои В-лимфопоэзом (в пользу первого).

1.3 TNFб

Фактор некроза опухоли б (TNFб) представляет собой полипептид с мо;

лекулярной массой около 17 kDa, в молекуле 157 аминокислотных остатков, тример. Рецепторы: TNFR-I (CD120a, р55), TNFR-II (CD120b, p75). Клетки-продуценты: активированные макрофаги, активированные нейтрофилы, NK, тучные, миелоидные, эндотелиальные клетки и клетки нейроглии. Существует три основных направления действия TNFб:

· цитотоксическое, направленное на клетки опухоли либо клетки, пораженные вирусами;

· иммуномодулирующее и противовоспалительное, вызываемое активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток;

· влияние на метаболизм, способный привести к гипергликемии, резорбции кости и увеличению мышечного гликогенолиза, т. е. кахексии, наблюдаемой при некоторых паразитарных инфекциях.

В результате высвобождения TNFб повышается проницаемость капилляров, повреждается эндотелий сосудов, возникает внутрисосудистый тромбоз. Концентрация циркулирующего TNFб обычно очень низка (<5 пг/мл), однако она резко возрастает (максимум за 90 минут) после введения липополисахаридов и возвращается к норме в течение 4-х часов. Высокие уровни TNFб (>300 пг/мл) обнаруживают во время септического шока. Сохранение высоких уровней указывает на возможность возникновения нежелательных последствий. Было показано, что у ВИЧ-инфицированных лиц в начальный период заболевания значительно увеличиваются концентрации TNFб. Повышенный уровень TNFб при СПИДе индуцирует репликацию вируса в инфицированных клетках по аутокринному или паракринному пути [14].

1.4 IL -10

Интерлейкин 10 — это лимфокин с молекулярной массой 17−21 kDa, в молекуле 160 аминокислотных остатков, гомодимер, продуцируемый Т-клетками (Th2), макрофагами и В-лимфоцитами, инфицированными вирусом Эпштейна-Барр (один из вирусных генов кодирует белок, гомологичный IL-10); может рассматриваться как антагонист ряда цитокинов. Так, IL-10 подавляет продукцию IFNg Th1-клетками. Кроме того, он тормозит пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, а также подавляет секрецию активированными моноцитами IL-1 В, TNF и IL-6. В то же время IL-10 стимулирует секрецию Ig В-клетками. IL-10 может стимулировать синтез IgE. В своем ингибирующем действии на клеточный иммунитет IL-10 синергичен с IL-4. При различных опухолях отмечено повышение уровня IL-10, при этом считается, что повышение уровня продукции IL-10 является плохим прогностическим признаком и сочетается с выраженной прогрессией опухолевого роста.

2. Методы оценки функционирования системы цитокинов

Цитокины являются локальными медиаторами, поэтому целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов из биоптатов соответствующих органов или в естественных жидкостях: моче, слёзной жидкости, жидкости дёсневых карманов, бронхоальвеолярном лаваже, вагинальном секрете, эякуляте, смывах из полостей, спинномозговой или синовиальной жидкости и др. Дополнительную информацию о состоянии иммунной системы организма можно получить при изучении способности клеток крови к продукции цитокинов in vitro.

Уровни содержания цитокинов в плазме отражают текущее состояние иммунной системы и развития защитных реакций in vivo. Спонтанная продукция цитокинов культурой мононуклеаров периферической крови позволяет оценить состояние соответствующих клеток. Повышенная спонтанная продукция цитокинов свидетельствует о том, что клетки уже активированы антигеном in vivo. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальную способность соответствующих клеток отвечать на антигенную стимуляцию. Сниженная индукция цитокинов in vitro, например, может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Поэтому оба варианта изучения уровней цитокинов как в циркулирующей крови, так и при их продукции культурами клеток важны с точки зрения характеристики иммунореактивности всего организма и функции отдельных звеньев иммунной системы.

В настоящий момент диагностическая значимость оценки уровня цитокинов заключается в констатации самого факта повышения или понижения их концентрации у данного больного с конкретным заболеванием. Причём для оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания целесообразно определять концентрацию как противо-, так и провоспалительных цитокинов в динамике развития патологии [1].

2.1 Определение концентраций цитокинов в биологических жидкостях

Иммуноферментный твердофазный анализ

В настоящее время для анализа моноклональных антител широко используется метод, называемый ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) — иммуноферментный твердофазный анализ. Это метод выявления формирования иммунокомплекса — соединения антитела с антигеном [13].

Последовательность выполнения метода [Приложение 1, рис. 1]:

1. Первые моноклональные антитела (МКАТ) предварительно иммобилизуют на внутренних поверхностях ячеек твёрдого планшета для ИФА [Приложение 1, рис. 2]

2. В первые два вертикальные ряда ячеек планшета вносят по 100 мкл стандартов: А — 0 пг/мл исследуемого цитокина, В — 50 пг/мл, С — 250 пг/мл, D — 500 пг/мл, Е — 1000 пг/мл, F — 2000 пг/мл цитокина. В остальные ячейки вносили по 100 мкл образцов. Образцы и стандарты вносили в рекомендуемых буферах. Планшет инкубируют в течение 1,5 часов при 18−20° С. После инкубации раствор из ячеек удаляют с помощью пипетки. Затем ячейки трижды промывают внесением 300 мкл промывочного раствора. Остатки промывочного раствора удаляют с помощью пипетки

3. Вторые МКАТ, меченые биотином, вносят по 100 мкл и инкубируют образцы с ними в течение 1,5 часов при непрерывном встряхивании при +18° С. После инкубации раствор из ячеек удаляют с помощью пипетки. Ячейки трижды промывают внесением 300 мкл промывочного раствора в каждую из них. Остатки промывочного раствора удаляют

4. Конъюгат стрептавидин-пероксидазы, разбавленный 1:100 буфером, вносят в объёме 100 мкл в ячейки планшета и инкубируют при +18° С и непрерывном встряхивании в течение часа. После инкубации раствор из ячеек удаляют. За 10−15 минут до окончания инкубации готовят раствор тетраметилбензидина. Ячейки планшета, после удаления раствора, трижды промывают внесением 300 мкл промывочного раствора и 3−5 раз дистиллированной водой с последующим удалением её встряхиванием планшета над раковиной. В результате данных операций формируется «сэндвич», состоящий из следующих слоев: фиксированное антитело — образец (цитокин) — связанное с ферментом антитело

5. Добавляют 200 мкл раствора тетраметилбензидина. Инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Останавливают реакцию добавлением 50 мкл раствора 1н серной кислоты. Расщепление субстрата ферментом приведет к изменению окраски первого. А по изменению окраски субстрата узнают о присутствии цитокина, который был в образце. Учёт результатов, определяющих активность связанной пероксидазы, проводят с использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине волны 492 нм, устанавливая нулевое поглощение по лункам со стандартом без определяемого цитокина в растворе. Количественную оценку результатов проводят методом построения калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентрации антитела. Чувствительность метода при использовании отечественных тест-систем — 5 — 30 пг/мл [10].

Данный метод обладает рядом преимуществ:

1. высокой чувствительностью;

2. возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

3. стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

4. простотой проведения реакции;

5. наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;

6. возможностью автоматизации всех этапов реакции

7. относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

РИА

Этот высокочувствительный метод разработан более 30 лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас этот метод очень широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, цитокинов, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).

В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Исследуемым материалом обычно является плазма или сыворотка крови, реже — другие биологические субстраты (цереброспинальная жидкость, моча, слюна и т. д.). Немеченным антигеном является искомое вещество (цитокин), меченый антиген представляет собой аналог искомого вещества, соединенный с радиоактивной меткой. Вещество, идентичное определяемому, получают двумя способами. Из биологических жидкостей, тканей или культур клеток путем очистки методами гельхроматографии, ионообменной хроматографии, электрофореза получают натуральные препараты. С помощью химического синтеза получают синтетические аналоги целых молекул определяемого вещества или их фрагментов, которые являются наиболее значимыми для иммунологической реакции, то есть содержат так называемые антигенные детерминанты. Радиоактивный изотоп, которым метят антиген, в идеале должен обладать следующими качествами:

1. не изменять иммунореактивность лиганда;

2. быть стабильным;

3. иметь высокую удельную радиоактивность.

В наибольшей степени указанным требованиям отвечают изотоп йода ¹²⁵I, излучающий гамма-кванты, и изотоп водорода — тритий ³Н, испускающий бета-частицы. Радионуклид ¹²⁵I менее стабилен по сравнению с тритием, в связи с чем реактивы с данной меткой необходимо использовать в течение 3−8 недель, однако препараты йода более просты для радиометрии. Антигены, меченные тритием ³Н, дольше сохраняются (до 3−6 месяцев), но имеют сравнительно низкую удельную радиоактивность и требуют специальных приборов для радиометрии — жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Общие требования к связывающему реагенту следующие. Он должен обладать высокой специфичностью и высоким сродством к связываемому веществу. Специфичность определяется способностью связывать только анализируемую субстанцию и быть индифферентным к другим веществам, в том числе со сходным строением. Степень прочности образованной связи характеризует сродство связывающего реагента к лиганду. Известен ряд материалов, которые способны весьма эффективно адсорбировать на своей поверхности биологические вещества. Например, полистирол обладает высоким сродством к большинству белков, однако образованная связь носит неспецифический характер.

Солевые, или буферные растворы, используемые при проведении РИА, предназначены поддерживать в течение всего исследования оптимальный для иммунологической реакции рН системы. Чаще всего применяются фосфатный, боратный, барбитуратный буферные растворы и трисбуфер. Какое именно соединение используется для обеспечения буферных свойств, не имеет существенного значения, но рН раствора должен быть в пределах нейтральных значений. Допустимы колебания только в сторону увеличения — от 7,4 до 8,6, так как кислая реакция среды препятствует образованию комплексов [антиген-антитело].

Методика РИА проста и включает следующие основные этапы [Приложение 2, рис. 1]:

1. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

2. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

3. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их надо отделить от свободного меченного антигена. Наиболее распространены два способа разделения:

а) К реакционной смеси добавляют вещество, повышающее ее плотность, например полиэтиленгликоль.

б) К реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. Для этого используют вторые антитела либо стафилококковый белок A.

В обоих случаях иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

4. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченного антигена.

К основным преимуществам радиоиммунологического анализа относятся:

1. высокая чувствительность — способность определять минимальные количества вещества, приблизительно равные 10−14 — 10−15 моль/л;

2. специфичность — способность системы измерять только одну, строго определенную субстанцию;

3. надежность — способность определять истинное количество вещества;

4. точность, которая заключается в воспроизводимости полученных результатов [10].

Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки. Кроме того, диагностика посредством радиоиммунного анализа предусматривает наличие специализированной лаборатории, а также использование дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

Мультиплексный анализ

Мультиплексная технология — очень перспективное направление в биологии. Она уже получила большое распространение в ПЦР-анализе и завоевывает ведущие позиции в проточной цитометрии. Мультиплексный анализ позволяет оценивать несколько растворимых аналитов одновременно в образце небольшого объема.

В определении количества цитокинов данный метод имеет несколько преимуществ:

1. Одновременный анализ до 100 цитокинов в одном образце

2. Многократное уменьшение объёма исследуемого образца

3. Увеличение воспроизводимости результатов

4. Снижение стоимости исследования и трудозатрат [13].

В основе метода — набор стандартных процедур иммуноферментного анализа. Антитела в данном случае адгезированы не в планшете, а на микрошариках [Приложение 3, рис. 1]. Частицы, покрытые антителами к различным молекулам, отличаются друг от друга по размеру (4,4 и 5,5 мкм) и интенсивности флуоресценции, что позволяет легко их идентифицировать в смеси при анализе на проточном цитофлуориметре. Смесь может содержать десятки видов частиц (равные количеству исследуемых веществ).

На первом этапе образец инкубируют с микрочастицами и биотинилированными антителами. Происходит связывание исследуемого вещества с соответствующими антителами пропорционально его количеству. Затем образец и несвязавшиеся антитела удаляют путем отмывки и добавляют вторые антитела, помеченные флюоресцеином. После инкубации и отмывки образцы анализируют на проточном цитофлуориметре. Концентрация исследуемого вещества пропорциональна интенсивности свечения флюоресцеина на соответствующей популяции микрошариков. Точные значения концентраций рассчитывают с помощью специального программного обеспечения (которое входит в состав набора) в соответствии с калибровочным графиком [10].

Анализ занимает около 4 часов, в качестве исследуемого материала используется 200 мкл сыворотки или плазмы или ~2 мл культуральной среды.

2.2 Изучение синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток

Иммуноцитохимия

Идея локализации антигенов в тканях с помощью антител впервые была реализована в начале 40-х гг. Впоследствии иммуноцитохимические методы стали широко применяться в молекулярной клинической диагностике, а с середины 70-х гг., после открытия моноклональных антител, их роль еще более возросла.

Иммуноцитохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные компоненты (в нашем случае цитокины), основываясь на их связывании с антителами. Место связывания определяют при помощи меченых антител или методом вторичного мечения.

Препараты для ИЦХ могут быть трех типов:

а) отпечатки;

б) мазки, полученные подходящими цитологическими или гематологическими методами;

в) препараты, полученные центрифугированием клеточных суспензий. Последний метод предпочтителен, когда в распоряжении исследователя имеются биологические жидкости с небольшим количеством клеток.

Делают срезы тканей и инкубируют их в растворе с антителами к антигену интереса (цитокину). Антитело часто связано с флуоресцентным красителем, так что можно увидеть локализацию антигена. Когда антитело находит антиген и формирует с ним комплекс, свободные антитела отмывают, и флуоресцентный краситель остается в местах локализации антигена. Используя спектрофотометр или флуоресцентный микроскоп, можно выяснить локализацию флуоресцентного красителя и, следовательно, определить, где внутри клетки находится антиген [13].

Причины широкого применения ИЦХ очевидны: широкий выбор качественных реагентов, простота реализации и обучения персонала навыкам учета результатов, а при световой микроскопии — возможность сопоставления с морфологией, хранения и транспортировки препаратов, отсутствие необходимости в узкоспециальном оборудовании. Отрицательными моментами, несомненно, являются, субъективность визуальной оценки, трудность организации контроля качества, невозможность учета большого количества клеток и, как следствие, вероятность неадекватной оценки малоклеточных популяций.

ELISPOT

Метод ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot) является высокочувствительной модификацией метода ИФА, позволяющей количественно определять клетки, секретирующие определенный тип цитокина на уровне единичной клетки. Уникальная высокая чувствительность метода ELISpot определяется тем, что детектируемый продукт в момент анализа находится на поверхности секретирующей клетки, будучи связанным с ее рецепторами. Кроме того, стимуляция продукции цитокина происходит in vitro непосредственно перед детекцией. В результате метод ELISpot позволяет выявлять 1 секретирующую цитокин клетку из 100 000 клеток, что в 20 — 200 раз точнее стандартного ИФА.

Схема метода ELISpot:

1. Цитокин специфичеcкие антитела иммобилизуются на дне PVDF микропланшет.

2. Блокируют несвязанные сайты с помощью протеина.

3. Добавляются клетки с/без активатора. В течение инкубации клетки активируются и начинают производить и секретировать цитокины, которые специфично связываются с первичными антителами.

4. Отмывка клеток

5. Добавляются вторичные антитела, которые либо конъюгированы с ферментом или биотинилированы.

6. При использовании биотина дополнительно добавляется стрептавидиновый конъюгат.

7. Добавляется субстрат, в результате появляется окрашенное пятно в месте локализации секретирующей клетки.

8. В результате подсчета числа пятен c помощью ELISpot Reader AID в исследуемых образцах и контролях (без активатора) определяют количество клеток, продуцирующих определенный цитокин [13].

Цитофлюориметрия

На сегодняшний день это ведущий метод в клинической иммунологии. Он может быть использован для оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями.

Общие принципы проточной цитометрии включают в себя проведение оптических и флуоресцентных измерений отдельных клеток в жидком световом потоке, во время их прохождения отдельным рядом через монохроматичный свет, обычно продуцируемый лазером. В этом случае физические свойства клеток, такие как размер или цитоплазматическая гранулярность, могут быть измерены на какой-нибудь отдельной неокрашенной клетке. Клетки также могут быть помечены специфическими красителями или целым набором флурохром-коньюгированных антител, направленных к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток [10].

Цитофлюориметрия позволяет оценить продукцию цитокина на уровне одной клетки с помощью внутриклеточного окрашивания. Комбинация внутриклеточного и поверхностного окрашивания дает возможность максимально детализировать информацию о клетке-продуценте — принадлежность к классу, подклассу, функциональная активность и т. д. Базальный уровень цитокинов в покоящихся клетках довольно низкий, поэтому предварительно проводят стимуляцию клеток in vitro в присутствии индукторов продукции цитокинов и блокаторов внутриклеточного транспорта (брефелдин А, моненсин). Затем окрашивают поверхностные маркеры, фиксируют, пермеабилизуют клетки и добавляют антитела к внутриклеточным маркерам. Далее клетки помещаются в контейнер для проб проточного цитометра и под давлением впрыскивается в центр быстродвижущегося в том же направлении потока жидкости через специально разработанный наконечник, в результате чего скорость движения клеток резко возрастает и они выстраиваются, образуя столбик, окруженный оболочечной жидкостью. Геометрия наконечника позволяет создать условия ламинарного потока струи образца, в результате чего не происходит перемешивания суспензии исследуемых клеток с обтекающей жидкостью. Попадая в дальнейшем в измерительную камеру прибора, клетки поочередно пересекаются лучом лазера и возбуждаются светом определенной длины волны. В свою очередь, клетки посылают световые сигналы другой длины волны, которые, проходя через систему оптических линз, фильтров, двухцветных зеркал, регистрируются фотоэлектронным умножителем, преобразующим эти световые сигналы в электрические, обрабатываемые компьютером. Два или три флуоресцентных сигнала, каждый из которых сообщает о реакции одного моноклонального антитела со специфически распознаваемым антигеном могут быть собраны с клеток вместе с сигналами переднего (FSC-forward scatter) и бокового светорассеяния (SSC-side scatter) [Приложение 4, рис. 1]. Сигналы светорассеяния, характеризующие размер клетки (FSC), а также цитоплазматические и мембранные особенности (SSC) привязывают флуоресцентный анализ к морфологически определенным популяциям. Полученные данные могут быть записаны, проанализированы и представлены в виде гистограмм. При этом в случае одномерной гистограммы на оси абсцисс откладывается интенсивность флюоресценции клеток, а по оси ординат число клеток с определенной интенсивностью флюоресценции. Суммировав полученные данные по всей популяции клеток образца, можно провести точный количественный популяционный и субпопуляционный анализ [13].

Таким образом, сейчас существует немало методов для оценки функционирования системы цитокинов. До недавнего времени в России изучением цитокинов занимались немногочисленные группы исследователей, так как биологические методы исследования очень трудоёмки, а импортные иммунохимические наборы весьма дороги. С появлением доступных отечественных иммуноферментных наборов все больший интерес к изучению цитокинового профиля проявляют практикующие врачи.

2.3 Изучение экспрессии генов цитокинов

Цитокины — сигнальные молекулы иммунной системы. Уровень экспрессии этих белков имеет важное диагностическое значение для подбора иммунокорригирующей терапии и прогноза интенсивности и направленности иммунного ответа. Для того чтобы определить, какие цитокины и в каком количестве синтезируются, широко применяется метод ПЦР.

Полимеразная цепная реакция — метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить несколько специфических молекул ДНК в присутствии миллионов других молекул. Открытие метода полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. С помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20−40 тысяч пар нуклеотидов.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

1. Выделение ДНК

2. Амплификация ДНК-фрагментов

3. Детекция ДНК-продуктов амплификации Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256… С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны. Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флюоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами.

2.4 Анализ полиморфизма генов цитокинов

Исследование генов, контролирующих активность цитокинов, являющихся медиаторами воспаления, — одна из важных задач в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения заболеваний, выявление на ранних сроках предрасположенности к заболеваниям. Знание их роли в патогенезе многих заболеваний позволяет, с одной стороны, прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее течения, с другой — индивидуально подобрать специфическую терапию для конкретного пациента [12].

Генетический контроль экспрессии провоспалительных цитокинов достаточно широко изучен. Рассмотрим функциональный полиморфизм гена TNFA. Ген TNFA расположен на шестой хромосоме (6p21.3) в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-A, B, C) и второго классов (HLA-DP, DQ, DR). Расположение в средней части генома определяет большую вариабельность локуса, в частности, промоторная зона гена TNFA включает восемь полиморфных участков с единичными нуклеотидными заменами: -1031T/C, -863C/A, -857C/T, -575G/A, -376G/A, -308G/A, -244G/A, -238G/A. Однако наиболее значимыми для человека считаются два. Это единичные нуклеотидные замены гуанина на аденин в положениях: -308 (GRA) и -238 (GRA), которые вызывают изменения уровня продукции TNFб, т. е. являются функциональными. Позиции -308 и -238 приходятся на промотор, что сказывается на возможности транскрипционных факторов связываться с этой частью гена и, таким образом, влиять на скорость транскрипции. Полиморфизм -308 повышает транскрипционную активность гена TNFA и, соответственно, продукцию цитокина. Наиболее активная транскрипция полиморфного гена TNFA (-308*А) идет в макрофагах: в них она в 5 раз выше, чем транскрипция нормального гена -308*G. Учитывая тот факт, что макрофаги — основной источник TNFб, их генетически обусловленная способность к увеличенной продукции провоспалительного цитокина может отражаться на развитии воспалительных и иммунных реакций организма [8].

Еще одним полиморфным участком гена TNFA, влияющим на продукцию цитокина, является положение -238. Однако, в данном случае замена гуанина на аденин ведет не к повышению, а к понижению продукции белка. Так, стимуляция клеток цельной крови липополисахаридом показала, что клетки с генотипом -238GA синтезируют в 1,5 раза меньше TNFб, чем клетки с генотипом -238GG [15].

При ревматоидном артрите, который мы рассмотрим в 3 главе, ведущая роль в патогенезе принадлежит провоспалительным цитокинам — IL-1 В и TNFб. При исследовании было выявлено, что пациенты, имеющие генотип -308G/A гена TNFA, имеют более тяжелое течение РА, чем несущие G/G генотип. У пациентов с аллелем G/A отмечалось более раннее начало заболевания, более высокая активность, большее число эрозий. В то же время, в других популяциях больных рассматриваемый аллельный вариант гена TNFA не влиял на тяжесть и течение РА и не был ассоциирован с этим заболеванием. При исследовании полиморфизма гена IL1B в точке (+3953 RТ) 5-го экзона было выявлено, что генотип Т/T (А2А2 аллель) ассоциирован с более активным РА по сравнению с генотипами C/C и C/T. Из других данных известно, что наличие аллеля Т в этой точке ассоциировано с большим числом эрозий при РА и высокой экспрессией гена in vitro [9].

Одним из наиболее негативных последствий бактериального инфицирования организма является септический шок. Основным эндогенным медиатором развития септического шока служит TNFб. В высоких концентрациях он способен вызывать активацию эндотелия, приводящую к расширению сосудов и падению артериального давления, диссеминированному внутрисосудистому свертыванию крови (ДВС-синдром), полиорганной недостаточности, нарушению терморегуляции, что в сумме ведет к летальному исходу. При генотипировании детей было показано, что присутствие хотя бы одной копии высокопродуцирующего аллеля -308*А в генотипе ребенка повышает вероятность летального исхода в 2,5 раза. Смертность детей с полиморфным генотипом -308 (AG, AA) была в 3 раза выше по сравнению с носителями гомозиготного варианта (-308 GG) гена TNFA. То же касается и астмы: замена G на A в позиции-308 связана с повышенной выработкой этого цитокина, что сопряжено с риском развития аутоиммунной патологии. Также выявленная взаимосвязь повышенной частоты аллеля IL-10 -592А с тяжестью сепсиса, развитием полиорганной недостаточности и высокой вероятностью летального исхода [12].

У ВИЧ-инфицированных больных наблюдается ряд различий с контрольной группой здоровых людей в частоте сочетаний аллельных вариантов генов цитокинов, связанных с появлением A/A гомозиготного варианта гена IL-10 (RR = 2,36), не выявленного у здоровых лиц, и отсутствием гомозиготного A/A варианта гена TNFA (RR = -12,25), обнаруженного у 4% здоровых женщин. Частота A/G варианта гена TNFA в четыре раза выше у больных (RR = 4,67) за счет снижения частоты обоих гомозиготных вариантов [6].

Ген IL1RN кодирует IL-1RA и локализован во 2 хромосоме. Носительство аллеля IL1RN*2 связано с повышенным уровнем циркулирующего IL-1RA и уровнем экспрессии мРНК в ходе воспаления. Влияние полиморфизма генов IL1B (кодирующего IL-1в) и IL1RN на характер воспаления можно описать в виде следующих тенденций: носительство немутантных вариантов этих генов определяет адекватную продукцию соответствующих белков и регуляцию функционирования системы IL-1; у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону продукции IL-1 В воспаление протекает более остро, у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки IL-1RA воспалительный ответ более продолжителен, что может являться причиной хронизации воспаления. Уровень IL-1RA в плазме крови скоординирован и совместно регулируется генами IL1B и IL1RN, а носительство IL1RN*2 ответственно за повышенный уровень как циркулирующего IL-1RA, так и IL-1 В, увеличенная активация экспрессии и продукции которого является следствием сверхвыработки IL-1RA. Согласно этой версии, при реализации воспалительного ответа у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки IL-1RA количество этого белка больше, чем необходимо для адекватной реализации воспаления, что вызывает компенсаторное образование еще большего количества IL-1 В. При этом и IL-1RA в ответ вырабатывается тоже больше. Таким образом, носительство сочетаний генов IL1B и IL1RN, определяющих перевес в сторону выработки IL-1RA, приводит к более продолжительному воспалительному ответу [15].

Таким образом, исследования полиморфизма генов как фактора генетической предрасположенности к различным заболеваниям человека открывают новые горизонты в выявлении групп риска и выборе наиболее оптимальной терапии для каждого пациента. В будущем можно ожидать появление превентивных методов коррекции предрасположенности к широкому спектру заболеваний.

3. Роль цитокинов в патогенезе заболеваний человека. Оценка в патологии и современные подходы к терапии

3.1 Сепсис

Сепсис описывают как комплексный клинический синдром, который является результатом опасного повреждающего ответа организма на инфекцию. Сепсис развивается, когда начальный соответствующий ответ организма на инфекцию усиливается и становится неконтролируемым. Клинические проявления включают лихорадку, спутанное сознание, кратковременную гипотензию, уменьшение диуреза или необъяснимую тромбоцитопению. Сепсис является кульминацией комплексных взаимодействий между микроорганизмами-патогенами и иммунной, свертывающей системами организма.

Цитокинам отводится ведущая роль в развертывании медиаторного механизма сепсиса. При сепсисе имеет место неотрегулированная экспрессия различных цитокинов, поэтому с целью коррекции нарушений функций макрофагов иммуномодуляторами необходимо подходить к оценке нарушений соотношения цитокинов комплексно и анализировать их уровни в динамике. Считается, что ведущую роль в развитии генерализованного воспалительного каскада при сепсисе играют TNFб и IL-1 В. У большинства больных сепсисом в начальных стадиях выявляется устойчивое повышение в крови этих цитокинов. Продукция TNFб до начала лечения выше нормы в 65,4 раза. Продукция IL-1RA остаётся низкой до начала лечения в 3,8 раза. До начала лечения индуцированная продукция IL-1 В у пациентов повышается в 1,45 раз [Приложение 5, рис. 1] [3].

Современным подходом терапии сепсиса является цитокинотерапия Ронколейкином совместно с антибиотиками. При подкожных инъекциях вводят в каждую точку не более 0,25 мг препарата. Как правило, больные адекватно отвечают на проводимую терапию, и никаких осложнений не возникает. Лишь у некоторых больных отмечается кратковременный озноб с непродолжительным по времени подъемом температуры до 38−39°С, умеренный акроцианоз и легкая эйфория. Других неблагоприятных явлений обычно не наблюдается. Развитие подобных реакций свидетельствует об активации цитокиновой реактивности и является адекватным ответом иммунной системы на введение rIL-2. По мере снижения микробной нагрузки макрофаги начинают синтезировать IL-10 и растворимые рецепторы TNF. Их действие направлено на подавление генерализованной воспалительной реакции. Через месяц после завершения курса лечения наблюдается снижение продукции провоспалительных цитокинов.

3.2 Аутоиммунные заболевания

Аутоиммунные заболевания — это класс разнородных по клиническим проявлениям заболеваний, развивающихся вследствие патологической выработки аутоиммунных антител или размножения аутоагрессивных клонов киллерных клеток против здоровых, нормальных тканей организма, приводящих к повреждению и разрушению нормальных тканей и к развитию аутоиммунного воспаления. Главным в возникновении и развитии АИЗ является распознавание собственных структур организма иммунокомпетентными клетками и их последующая активация, пролиферация и индукция воспаления. Принято считать, что цитокины являются необходимыми элементами развития АИЗ [2].

Ревматоидный артрит

Ревматоидный артрит — хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани с прогрессирующим поражением преимущественно периферических (синовиальных) суставов по типу симметричного прогрессирующего эрозивно-деструктивного полиартрита. Ревматоидный артрит относится к заболеваниям с неизвестной этиологией, в развитии которого играет роль генетическая предрасположенность и триггерные воздействия [8]. Современные представления о патогенезе ревматоидного артрита основываются на нескольких взаимодополняющих представлениях, учитывающих:

1) участие Т-лимфоцитов;

2) значение моноцитмакрофагальных клеток, синтезирующих цитокины, которые обладают провоспалительной активностью;

3) роль автономных неиммунных механизмов, определяющих опухолеподобный рост синовиальной ткани, приводящий к деструкции суставного хряща.

В развитии ревматоидного воспаления важная роль отводится моноцитам и макрофагам. В синовиальной жидкости и тканях суставов при ревматоидном артрите содержится избыточное количество TNFб и IL-1 В при минимальном содержании Т-клеточных цитокинов (IL-2, -3 и -4, интерферон-гамма). TNFб и IL-1 В могут усиливать экспрессию молекул адгезии на мембранах эндотелия сосудов синовиальной мембраны и их лейкоцитарных лигандов, индуцировать синтез хемотаксических факторов (IL-8 и моноцитарный активирующий фактор), а также стимулировать продукцию фактора роста фибробластов и медиаторов воспаления. TNFб и IL-1 В активно синтезируются в синовиальной мембране в основном клетками моноцитарно-макрофагального ряда. IL-1 В и TNFб являются мощными индукторами синтеза IL-6, который, воздействуя на гепатоциты, приводит к гиперпродукции острофазовых белков (С-реактивного, амилоидного белков, фибриногена и др.). IL-6 наряду с IL-1 В принимает участие в развитии околосуставного остеопороза. Большую роль в патогенезе ревматоидного артрита играют тучные клетки, которые, выделяя гистамин, IL-4 и -6, стимулируют Ти В-лимфоциты, а гепарин, синтезируемый тучными клетками, активирует макрофаги. Через IL-1 В и TNFб осуществляется контакт тучных клеток с синовиоцитами, пролиферация которых в свою очередь сопровождается синтезом ПГ Е2. Одновременно с этим происходит активация ферментативных систем, разрушающих хрящ [11].

Было проведено исследование и выяснено, что дополнительное назначение к болезнь-модифицирующим препаратам (метотрексат и сульфасалазин) симвастатина в дозе 40 мг/сут. ассоциировано со снижением активности артрита, что характеризуется уменьшением числа припухших и болезненных суставов и улучшением субъективного состояния. Противовоспалительное действие статинов обусловлено их плейотропными эффектами на пролиферацию, дифференцировку и функции клеток иммунной системы, в частности подавляют избыточную выработку провоспалительных цитокинов [9].

Астма

Астма — это одно из наиболее распространённых хронических неспецифических заболеваний. Патогенез астмы очень сложен. В формировании иммунного ответа воспаления участвуют иммунные реакции 1, 3 и 4 типов, но чаще других ведущую роль играет механизм 1 типа реакции. Определение выработки цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНПК) при стимуляции in vitro является более адекватным по сравнению с определением плазменного уровня цитокинов. При активации in vitro такими агентами, как фитогемагглютинин (PHA) и бактериальный липополисахарид (LPS), МНПК секретируют в культурную среду целый спектр провоспалительных цитокинов. Выраженная спонтанная продукция цитокинов МНПК свидетельствует о том, что клетки уже активированы in vivo либо in vitro в результате методических манипуляций. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток.

При исследования спонтанной и индуцированной стандартными митогенами (PHA и LPS E. coli) продукции цитокинов в супернатантах цельной крови было показано что:

1. спонтанная продукция провоспалительного цитокина IL-1 В снижена в сравнении с условно здоровыми, в то время как спонтанная продукция IL-1 В у больных астмой в стадии ремиссии достоверно выше, чем в стадии обострения.

2. При определении индекса соотношения PHA-индуцированной и LPS-индуцированной продукции IL-1 В индекс значительно ниже у лиц с астмой в стадии обострения, чем в стадии ремиссии. Также эти результаты ниже в сравнении с условно здоровыми лицами [Приложение 6, рис. 1]

3. Спонтанная продукция IL-10 достоверно выше в стадии обострения астмы в сравнении с астмой, а стадии ремиссии и с группой условно здоровых

4. Достоверное повышение уровня IL-10 у больных астмой в стадии обострения получено и при PHA-индуцированной и LPS-индуцированной продукции IL-10 в сравнении с двумя другими группами

5. При подсчёте индекса соотношения PHA-индуцированной продукции IL-10 к спонтанной выявлено статистически достоверное снижение индекса при астме в обострении в сравнении с условно здоровой группой.

Полученные данные показывают, что при астме синтез и активация цитокинов зависит от фазы заболевания. В стадии обострения наблюдается дисбаланс прои противовоспалительных цитокинов, уровень противовоспалительного IL-10 повышается, его действие направлено на процесс затухания воспаления [5].