Люминесцентный анализ. 
Флуоресценция как метод химического анализа воды

Свечение атомов, молекул, ионов и других более сложных комплексов, возникающее в результате электронного перехода в этих частицах при их возвращении из возбужденного состояния в нормальное, называется люминесценцией^[1][2]. Первое описание люминесценции как специфического свечения раствора оставил в 1577 г. испанский врач и ботаник Николас Монардес. В 1852 г. Дж. Г. Стокс установил связь между интенсивностью флуоресценции и концентрацией. Он же предложил использовать флуоресценцию как метод химического анализа. Первый пример практического определения A1 (III) по люминесценции его комплексов с морином опубликовал А. Гоппелынредер в 1867 г. Он же ввел термин «люминесцентный анализ».

Сегодня люминесцентный анализ охватывает широкий круг методов определения разнообразных объектов — от простых ионов и молекул до высокомолекулярных соединений и биологических объектов. Детектируется люминесценция самого объекта или его производных, возможно также использование изменения люминесценции специфичных агентов. Для сложных проб люминесцентное детектирование сочетается с химическим разделением (хроматография, электрофорез) или с биологическим выделением (иммуноанализ, метод полимеразной цепной реакции — ПЦР).

В реальных условиях наблюдается одновременно свечение огромного числа молекул, которые излучают свет независимо друг от друга, давая некогерентное излучение. При этом происходит полное преобразование поглощенной энергии в собственное излучение, что отличает люминесценцию от явлений рассеяния и отражения света. Существует большое количество разнообразных, как органических, так и неорганических веществ, обладающих люминесцентной способностью, которая может существенно различаться. Это вызывает необходимость в классификации явлений люминесценции.

В основу первой попытки такой классификации была положена продолжительность процесса излучения. В результате все известные виды люминесценции были разделены на два больших класса, получивших название флуоресценции и фосфоресценции. Под флуоресценцией понималось свечение, мгновенно (~ 10~⁹ с) затухающее после прекращения возбуждения; фосфоресценцией стали считать свечение, продолжающееся в течение заметного промежутка времени (10^_6 с) после прекращения возбуждения. Классификация носила чисто качественный характер и не позволяла установить четкую границу между этими двумя видами свечения.

В основу второго типа классификации были положены различные виды возбуждения люминесценции. В случае возбуждения вещества световыми квантами возникающее свечение стали называть фотолюминесценцией. В настоящее время выделяют особый вид фотолюминесценции — атомную флуоресценцию, соответствующую световому возбуждению свечения атомов веществ, находящихся в газообразном состоянии. Свечение, возникающее под действием катодных лучей, было названо катодолюминесценцией. При возбуждении свечения рентгеновскими лучами возникает рентгенолюминесценция.

В основу третьего вида классификации, предложенного С. И. Вавиловым, положена кинетика самого процесса люминесценции. Согласно ему свечение разделяют на резонансное, спонтанное, вынужденное и рекомбинационное. Резонансной флуоресценцией называется процесс излучения фотонов той же энергии, что и у поглощенных фотонов возбуждающего света (рис. 13.1.1, а). Этот тип флуоресценции имеет место в газах и молекулярных кристаллах. Резонансная флуоресценция лежит в основе процесса атомной флуоресценции.

При спонтанной люминесценции (рис. 13.1.1, б) после возбуждения осуществляется переход молекулы с невозбужденного уровня Е₀на высокий возбужденный электронный уровень Е_ь откуда молекула, растрачивая безызлучательным путем избыток сообщенной ей энергии, переходит на более низкий возбужденный уровень Е₂. Возвращение на исходный уровень Е₀ происходит с излучением кванта люминесценции. Излучаемый квант оказывается меньше поглощенного. Спонтанная люминесценция наблюдается у паров и растворов сложных молекул, молекулярных кристаллов, а также у примесных центров твердых тел. При резонансной и спонтанной люминесценции вероятность возвращения молекул из возбужденного состояния в нормальное определяется ее внутренними свойствами и не зависит от температуры.

Развитие вынужденной люминесценции происходит более сложным путем (рис. 13.1.1, в). В этой схеме кроме уровней Е₀, Е_1} Е₂ существует метастабильный уровень М, непосредственный переход с которого на уровень Е₀ является запрещенным. При возбуждении молекула попадает с уровня Е₀ на Е_ь с которого безызлучательным путем может перейти на уровень Е₂, а затем и на уровень М.

На метастабильном уровне М молекуле приходится находиться довольно долго, пока за счет внутренней колебательной энергии или тепловой энергии, сообщенной извне, она не перейдет обратно на уровень Е₂, с которого спонтанно возвратится на уровень Е₀, излучая квант люминесценции. Длительность излучения, в отличие от спонтанной люминесценции, в этом случае будет существенно зависеть от температуры. Спонтанное и вынужденное излучения наиболее характерны для молекулярных систем. Поэтому эти виды свечения часто объединяют одним понятием молекулярной люминесценции.

Рис. 13.1.1. Схема энергетических уровней и электронных переходов между ними при резонансной (а), спонтанной (б) и вынужденной (в).

люминесценции Рекомбинационная люминесценция имеет более сложный характер. Она возникает при воссоединении двух противоположных заряженных частей центра свечения, отделенных друг от друга в момент возбуждения.

Спектр люминесценции — это функция распределения излучающей веществом энергии по длинам волн или частотам. Каждой полосе поглощения соответствует полоса флуоресценции. Спектр возбуж

дения — это функция распределения излучаемой веществом энергии в зависимости от длины (или частоты) возбуждения. Спектры поглощения и возбуждения могут отличаться из-за различия химических и физических свойств молекул в возбужденном состоянии по сравнению с основным. Например, молекулы в возбужденном состоянии характеризуются иной геометрией и иными межатомными расстояниями (а значит, и другими дипольными моментами).

Применимость к разнообразным объектам, высокая чувствительность и селективность методов люминесцентного анализа сочетаются с возможностью реализации их на относительно недорогой и компактной аппаратуре.

Были исследованы спектры вторичного излучения проб воды, водных растворов некоторых органических соединений и взвесей микроорганизмов при ультрафиолетовом лазерном возбуждении¹. Авторы использовали разработанный в последние годы лазер на парах меди, характеризующийся сравнительно высоким коэффициентом полезного действия^[3][4]. Схема экспериментальной установки, использованной в данных исследованиях, приведена на рис. 13.1.2.

Для исследования спектров КР воды были подготовлены различные пробы, полученные путем очистки исходной воды с помощью фильтрующих систем, разработанных к настоящему времени промышленностью^[5]. Применение метода задержки в системе регистрации вторичного излучения позволило отделить сигнал флуоресценции от сигнала комбинационного рассеяния, синхронного с импульсом возбуждения. Для сравнения эффективности различных коммерческих фильтров были проанализированы спектры ФЛ проб воды, прошедших очистку с помощью этих фильтров. Результаты анализа спектров ФЛ таких проб воды для различных фильтров иллюстрирует рис. 13.1.3. На этом рисунке слева присутствует возбуждающая линия (X = 255,3 нм); затем виден резкий пик (показан стрелкой), соответствующий КР в воде на полносимметричном колебании vl = 3450 см^-1; при больших значениях длин волн проявляются полосы ФЛ, обусловленные присутствием ароматических хромофоров в пробах воды. На этом рисунке видно, что кривая 1 (фильтр «Аквафор Модерн») соответствует наименьшей концентрации ароматических компонентов. Для проведения количественного анализа были приготовлены образцы с различным содержанием ароматического компонента — флуорена.

На рис. 13.1.4 приводится сопоставление спектров ФЛ пробы воды, прошедшей через фильтр «Аквафор Модерн» (кривая 4), водного раствора флуорена с концентрацией 1 мкг/л (кривая 5) и других проб воды (кривые 1—3), взятых из природных источников. Из этого рисунка следует, что концентрация ароматических компонентов в пробе, соответствующей кривой 4, находится на предельно низком уровне — 1 нг/л. Для пробы 1 уровень концентрации превышает ПДК (1 мкг/л). В пробах 2, 3 концентрация ароматических компонентов ниже уровня ПДК.

Рис. 13.1.2. Блок-схема экспериментальной установки для наблюдения вторичного излучения в водных растворах ароматических соединений:

• 1 — блок питания лазера; 2 — активный элемент лазера; 3, 5, 12,15,
• 16 — кварцевые линзы; 4 — нелинейно-оптический кристалл; 6, 7,
• 9 — диэлектрические зеркала; 8 — экран; 10 — блок формирования стробимпульса; 11, 13, 17 — диафрагмы; 13 — кювета с исследуемым веществом;
• 18 — фотодиод; 19 — монохроматор; 20 — фотоумножитель; 21 — усилитель;
• 22 — блок питания ФЭУ; 23 — шаговый двигатель; 24 — система регистрации;
• 25 — компьютер; 26 — принтер

Присутствие межмолекулярных мод либрационного и трансляционного типа в спектрах КР чистой воды свидетельствует об образовании квазикристаллической сетки молекулярных кластеров, т. е. характеризует степень структурированности воды.

Структурированность воды является важным фактором, связанным с эффективностью усвоения воды клетками живых организмов. Интенсивность низкочастотных полос КР, обусловленных межмолекулярными кластерными колебаниями, может служить дополнительным критерием качества воды. Анализ вида спектров КР воды в низкочастотной области позволяет оценить степень структурирования воды, связанную с ее вкусовыми качествами и эффективностью усвоения организмами. Разработанная методика позволяет также установить присутствие в пробах тяжелой воды.

Рис. 13.1.3. Спектры КР и ФЛ различных проб воды:

I — «Аквафор Модерн», 2 — «Барьер», 3 — «Спринг», 4 — «Парагон», 5 — «Бриз», 6 — «Гейзер», 7 — исходная вода из водопроводной сети г. Москвы. Стрелка соответствует положению линии КР валентного колебания vl (А1) молекулы воды.

Рис. 13.1.4. Спектры КР и ФЛ водных проб:

1,2 — вода из водопроводной сети г. Москвы, 3 — «чистая» вода из Подмосковья, 4 — вода, очищенная с помощью фильтра «Аквафор Модерн», 5 — водный раствор флуорена с концентрацией 1 мкг/л. Возбуждение линией 255,3 нм. Стрелка показывает положение линии КР полносимметричного колебания vl (Al).

молекулы воды В работе Е. А. Ширшина и соавторов приводятся первые результаты исследования, направленного на создание лазерного метода определения парциальных концентраций уранила и его комплексов в водных средах^[6]. Этот метод может использоваться для оперативного прогноза экологически опасных явлений, связанных с добычей урана.

Образующаяся в результате добычи урана смесь представляет собой сильнорассеивающую мутную яркоокрашенную среду. Применение стандартной схемы зондирования здесь невозможно. Для решения этой проблемы был применен алюминат-неодимовый лазер с длиной волны 447 нм (третья гармоника его основной частоты)¹. Данная длина волны попадает в полосу поглощения урана в видимой области и лучше проходит через окрашенную среду. Для оптимального светосбора использовался приемо-передающий оптоволоконный зонд. С помощью этой техники удалось зарегистрировать сигналы флуоресценции при разных задержках строба приемника, соответствующих разным формам.

Был предложен и реализован алгоритм определения парциальных вкладов различных форм урана в их смеси в водной среде, что открывает возможность создания флуоресцентного онлайн сенсора для контроля технологического процесса добычи урана и экологического мониторинга водоемов, подверженных риску загрязнения урансодержащими примесями^[7][8].

• [1] Сидоренко В. М. Молекулярная спектроскопия биологических сред. М.: Высшаяшкола, 2004.
• [2] Левшин Л. В., Салецкий А. М. Оптические методы исследования молекулярныхсистем. Ч. 1. Молекулярная спектроскопия. М.: Изд-во МГУ, 1994.
• [3] Горелик В. С., Козлова Г. В. Ультрафиолетовая лазерная спектроскопия водных сред// Физические проблемы экологии. 2006. № 13.
• [4] Горелик В. С., Агальцов А. М., Моро Р. А. Лазерный анализатор молекулярнойструктуры и состава воды // Наука — производству. 2000 № 6. С. 7—12.
• [5] Горелик В. С., Козлова Г. В, Ультрафиолетовая лазерная спектроскопия водных сред.
• [6] Лазерная флуориметрия уранила и его комплексов в водной среде / Е. А. Ширшин[и др.] // Физические проблемы экологии. 2009. № 16.
• [7] Лазерная флуориметрия уранила и его комплексов в водной среде / Е. А. Ширшин[и др.].
• [8] Там же.