Эксперименты для выявления природы бета-лактамазной активности ротовой жидкости

• 1. Фракционирование образцов ротовой жидкости (n=4) при помощи препаративного диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле. По завершении электрофореза столбики геля разрезались на равные фрагменты длиной 0,5 см, после чего изолированно определялась бета-лактамазная активность каждого из них; расположение белковых фракций выявлялось путем окраски контрольных столбиков геля красителем Кумасси R250.
• 2. Обработка образцов ротовой жидкости с наиболее выраженной бета-лактамазной активностью (n=10) взвесью гранул голубой сефарозы (реактив, 1 мг которого избирательно связывает до 11,0 мг человеческого сывороточного альбумина, практически не взаимодействуя с другими белками; CAS 66 456−82−4) [17]. Данный эксперимент позволяет оценить долю бета-лактамазной активности ротовой жидкости, опосредованную сывороточным альбумином.

К 100 мкл проб ротовой жидкости добавлялось по 100 мкл взвеси гранул голубой сефарозы, смесь встряхивалась 30 минут, затем гранулы отделялись центрифугированием в течение 60 с при 14,5 тыс. об/мин.

3. Ингибирование бета-лактамазной активности образцов ротовой жидкости (n=16) раствором тазобактама (ингибитора бактериальных бета-лактамаз класса А) в конечной концентрации 5 мг/мл.

Образцы слюны сохранялись при ?20°С; непосредственно перед проведением исследования все пробы одновременно размораживались, после чего центрифугировались при 7.000 об/мин в течение 5 минут, затем отделялся прозрачный надосадок, который использовался в дальнейших исследованиях. В случае, если общий объем надосадка оказывался менее 0,2 мл, он доводился до 0,2 мл стерильным физиологическим раствором хлорида натрия.

Определение уровня бета-лактамазной активности ротовой жидкости выполнялось путем спектрофотометрической регистрации распада антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина, для чего использовалась тест-система «БиоЛактам» (ООО «СИВитал», РБ).

В основе тест-системы «БиоЛактам» лежит спектрофотометрическая методика, базирующаяся на изменении окраски синтетического антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина при распаде его бета-лактамной связи. При этом происходит батохромный сдвиг в хромофорной системе молекулы, и максимум ее поглощения меняется с 390 нм на 486 нм. Нитроцефин разрушается всеми известными бета-лактамазами [14]. Бета-лактамазная активность оценивалась в % распада стандартного количества нитроцефина, вносимого в каждую анализируемую пробу. Эксперименты выполнялись в соответствии со стандартной методикой, изложенной в инструкции, прилагаемой к тест-системе.