Комплементация. 
Основы микробиологии и вирусологии

Комплементацией называют взаимодействие генных продуктов вируса в смешанно-инфицированных клетках, которое приводит к увеличению выхода одного или обоих вирусов, в то время как их генотип остается неизменным. Это определение отражает тот факт, что один или оба вируса (мутанта) предоставляют белковый продукт, по которому другой партнер дефектен, что позволяет одному или обоим мутантам расти в смешанно-инфицированных клетках. Принцип комплементации заключается в том, что вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными.

Следовательно, если оба «родителя» дефектны по одному и тому же генному продукту (функции), то ни один из них не способен обеспечить недостающую функцию, и комплементации не происходит. Таким образом, тест на комплементацию можно использовать для классификации и объединения вирусных мутантов в различные функциональные группы. Полагают, что два мутанта, неспособные комплементировать друг друга, имеют дефект в одном и том же гене и генном продукте, тогда как мутанты, способные ко взаимной комплементации, имеют дефект в различных генах и генных продуктах. Теоретически возможно столько же комплементационных групп, сколько и генов. Однако абсолютная летальность некоторых мутаций или несущественная функция других часто приводит к тому, что число комплементационных групп меньше числа генов.

Комплементация может быть односторонней и двусторонней. Двусторонняя комплементация заключается в репродукции обоих партнеров, каждый из которых не способен к самостоятельной репродукции. При односторонней комплементации один из партнеров обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Вирус, стимулирующий репродукцию другого вируса, называется «вирус-помощник», а вирус, репродуцирующийся только в присутствии помощника, называется «вирус-сателлит».

Существуют два типа комплементации.

Наиболее типична — неаллелъная, или межгенная, комплементация, при которой мутанты, дефектные по различным функциям, помогают друг другу в репликации, предоставляя функцию, дефектную у другого вируса.

Аллельная, или внутригенная, комплементация наблюдается намного реже и происходит в том случае, если генный продукт, дефектный у обоих партнеров, образует мультимерный белок. В этом случае различные партнеры имеют дефект в разных доменах одного и того же белка. Если мультимерный белок состоит из субъединиц одного партнера, то он функционально неактивен. Однако, если мультимер состоит из субъединиц от обоих партнеров, он может принять функционально активную конформацию, и будет наблюдаться комплементация.

Комплементация встречается и у неродственных вирусов, принадлежащих к разным семействам. Одним из семейств, вирусы которого наиболее часто участвуют в комплементации, является семейство аденовирусов. В одних системах аденовирусы могут действовать как дефектные вирусы, в других — как помощники. Например, в культуре клеток почек макак резусов аденовирусы могут репродуцироваться только в присутствии 8У40, который является в данном случае вирусом-помощником.

Тест на комплементацию легче всего проводить с мутантами условно-летального типа. Для постановки такого теста клетки заражают совместно двумя мутантами, а в качестве контроля используют клетки, зараженные этими мутантами по отдельности. Зараженные клетки инкубируют в непермиссивных условиях (при высокой температуре в случае ts-мутантов). По истечении времени, достаточного для роста вируса, определяют суммарный выход при смешанной и раздельной инфекции, титруя вирус при пермиссивных условиях (низкой температуре в случае ts-мутаций). Индекс комплементации рассчитывают как отношение урожая вируса при смешанном заражении к сумме урожаев в раздельно зараженных контролях. Комплементацию измеряют по увеличению урожая при смешанной инфекции. Индекс комплементации >2,0 указывает на комплементацию.

Комплементация наблюдается в ряде природных ситуаций в системах с вирусами животных. При пассировании ряда вирусов при высокой множественности заражения спонтанно возникают делеционные мутанты. Такие мутанты характерны для препаратов вирусов, которые интерферируют с диким типом и другими мутантами. Делеционные мутанты не способны расти самостоятельно, но поддерживаются в популяции благодаря комплементации, которую обеспечивает небольшое 'количество вируса с полноценным геномом, присутствующее в популяции (вирус-помощник). Комплементация была обнаружена также у РНК-со-держащих трансформирующих опухолеродных вирусов.

Генная инженерия Разработка новых приемов для манипуляции с нуклеиновыми кислотами, обычно называемых «генной инженерией», открыла новые возможности для генетических исследований вирусов животных. В отличие от классической и молекулярной генетики, генная инженерия имеет своим объектом не клетки, не вирусы, а гены или их группы, оперируя с ними не как с биологическими объектами, а как с молекулами или фракциями молекул. Целью генной инженерии является пересадка генов в гетерогенные системы, их экспрессия для получения кодируемых генами белков — гормонов, ферментов, антигенов и других биологически активных веществ.

Основным инструментом генноинженерных работ являются некоторые ферменты и в первую очередь рестрик-тазы. С их помощью удается получить необходимые фрагменты геномов или отдельные гены. В большинстве случаев рестриктазы образуют «липкие концы» в местах разреза молекул ДНК, что дает возможность соединять концы разных генов или генетических элементов. В тех же случаях, когда «липкие концы» не образуются, их создают искусственно, используя ферменты — концевые нуклеотидил-трансферазы. Для ковалентных сшивок нитей ДНК применяются ферменты ДНК-лигазы. Для переноса в клетку вновь образованной генетической структуры в принципе могут быть использованы следующие методы: гибридизация соматических клеток, пересадка ядер и хромосом, трансформация клеток с помощью ДНК путем введения чужеродной ДНК в зародышевые и соматические клетки животных и прямая микроинъекция ДНК в ядро клетки. Чужеродный генетический материал можно вводить в клетку с помощью вектора. Вектор — это молекула ДНК, способная к автономной репликации и используемая для переноса чужеродной генетической информации в клетку. Векторами могут быть бактериальные плазмиды либо искусственные образования (бии тривалентные плазмиды, космиды — производные фагов и плазмид). Удобными векторами для эукариотических клеток являются некоторые ДНКи РНК-содержащие вирусы животных благодаря их способности к репродукции и существенному накоплению продуктов транскрипции и трансляции. К ним относятся вирусы полиомы, папилломы, 8У40, герпеса, аденовирусы, а среди РНК-со-держащих — ретровирусы. Одной из наиболее перспективных векторных систем является крупный ДНК-содержащий вирус — вирус осповакцины.

Генная инженерия создает новые возможности для получения вирусных вакцин, и эти возможности заключаются в создании вакцин, состоящих из протективных (вызывающих образование защитных антител) белков. Такие вакцины могут быть получены в прокариотических (бактериальных) системах и в системах низших эукариотов (например, в дрожжах). Однако большинство протективных антигенов вирусов человека являются продуктами сложных внутриклеточных модификаций, которые обычно не могут осуществить клетки прокариотов и низших эукариотов (антигены вирусов полиомиелита, гепатита А, гриппа и др.), и в этом случае для получения вакцин необходимо использовать клетки высших эукариотов, что делает генноинженерные вакцины против ряда инфекций нерентабельными. Однако для вирусов, которые плохо культивируются в лабораторных условиях (например, вирус гепатита, А и ряд кишечных вирусов — возбудителей гастроэнтеритов) этот путь остается единственно приемлемым.

Среди новых направлений по созданию генноинженерных вакцин весьма перспективным является использование крупных вирусов животных для введения в их геном генов протективных белков вирусов. Наиболее удачной моделью для этих манипуляций является вирус осповакцины. Этот вирус имеет громадный геном (187 кб), в который без ущерба для репродукции вируса можно встроить до 25 ко чужеродного генетического материала, т. е. несколько генов, кодирующих протективные белки вирусов. Получены штаммы вируса осповакцины со встроенным в область ранних генов гена НВ8-антигена. При внутрикожной прививке такой вакцины происходит размножение вируса осповакцины и развитие вакцинального процесса,: характерного для осповакцины. Одновременно происходят синтез НВ8-антигена вируса гепатита В, секреция его из очага вакцинации и индукция специфического иммунитета к гепатиту В. При этом реактогенность рекомбинантного штамма вируса осповакцины не только не повышается, но даже снижается по сравнению с исходным вакцинным штаммом.

Несмотря на большие успехи генной инженерии, трудности, стоящие перед ней, далеко еще не преодолены. Если принять за 100% путь от начала исследований до промышленного, коммерчески выгодного продукта, будь то вакцина, интерферон или гормон, то можно следующим образом оценить каждый из трех основных этапов этой задачи: получение рекомбинантных молекул на основе прокариотного или эукариотного вектора—10%, получение экспрессии интересующего исследователей гена — 30%, выход на экономически выгодную технологию—60%. И тем не менее, несмотря на все эти трудности, генная инженерия стала ядром современной биотехнологии и с каждым годом вклад ее в производсто будет возрастать.