Полиморфизм гена ГСТТ1, ассоциированный с онкопатологией различной локализации

Согласно современным представлениям молекулярной генетики, индивидуальные различия в степени развития тех или иных физических и психических качеств человека во многом обусловлены ДНК-полиморфизмами, которых насчитывается не менее 12 миллионов.

Считается, что все эти заболевания и врожденные пороки развития, занимающие наибольшее место в патологии человека, практически всегда являются результатом сочетанного действия, генетических и средовых факторов. Это означает, что одного только наследственного влияния недостаточно для развития таких болезней, впрочем, как и лишь одного влияния факторов окружающей среды.

Цель данной работы — рассмотреть влияние возможных полиморфизмов гена ГСТТ1 на риск развития ряда заболеваний, в связи с чем ставится ряд задач:

· Проанализировать встречаемость полиморфных вариантов гена ГСТТ1 у женщин с диагностированным РМЖ и у женщин, не имеющих данной патологии и оценить влияние носительства аллелей этих генов на риск развития РМЖ.

· Провести анализ литературных источников, статей, отчетов о возможном влиянии полиморфных вариантов гена ГСТТ1 на возникновение различных онкопатологий

· Исследовать влияние полиморфов ГСТТ1 на вероятность развития различных онкологических заболеваний, провести мета-анализ собранных данных с формированием вывода о роли гена ГСТТ1 в онкогенезе.

Белки семейства ГСТ — один из важнейших инструментов процесса биотрансформации ксенобиотиков в организме. Благодаря низкой специфичности, данные белки трансформируют большое количество различных ксенобиотиков и эндогенных отравляющих веществ.

Чтобы выяснить, влияет ли полиморфизм генов семейства ГСТ на заболеваемость, необходимо провести статистический анализ наличия варианта гена среди заболевших и здоровых людей. Для оценки вклада полиморфного варианта гена в развитие заболевания проводится мета-анализ. Мета-анализ позволяет объединить данные из различных исследований и обработать их с получением более точного результата, нежели при использовании статистического анализа.

Полученные в ходе работы сведения могут стать основой для дальнейших исследований гена ГСТТ1, в том числе популяционного исследования Беларуси на носительство вариантов этого гена.

До настоящего времени подобных масштабных исследований по Беларуси не проводилось.

Генотипирование по ГСТТ1 и другим генам, ответственным за биотрансформацию ксенобиотиков, позволит выделить среди населения группы риска, что поможет спланировать профилактические мероприятия для людей, входящих в эти группы, и, следственно, повысит вероятность ранней диагностики заболеваний.

1. Обзор литературы

1.1 Явление полиморфизма в генетике

Полиморфизм в генетике — длительное существование в популяции нескольких генетически различных форм особей, при котором распространенность самой редкой формы превосходит уровень спонтанного возникновения повторных мутаций. Пенетрантность полиморфного гена обычно выше, чем пенетрантность мутантного.

Аллели ряда локусов, обнаруживающие нормальный полиморфизм в естественной среде обитания человеческих популяций, могут стать «патологическими» в иных резко меняющихся окружающих условиях, а также при контакте людей с продуктами производственной деятельности.

Сравнительное исследование генетических особенностей групп больных продемонстрировало следующие результаты:

1. Пропорция редких аллелей по многим изученным локусам среди больных с профессиональной патологией, как правило, превышает таковую среди клинически здоровых производственников с высоким стажем работы на соответствующем предприятии.

2. Каждая из групп характеризуется своим сочетанием генотипических и аллельных концентраций.

3. Обнаруживается однотипный комплекс генетических особенностей для групп больных с той же патологией на однопрофильных предприятиях разных регионов и при этом отмечается аналогия в генетической структуре разных групп рабочих с высоким стажем производства

4. Наконец, на основании всего ряда независимых исследований установлено явление поляризации генотипических и аллельных частот.

Эффект поляризации заключается в противоположном расхождении концентрации одного и того же аллеля для групп больных c профессиональной патологией, с одной стороны, и для соответствующих резистентных по отношению к данным заболеваниям групп людей — с другой[1].

Явление поляризации частот аллелей оказалось также широко распространенным в случае предрасположенности к мультифакториальным болезням.

1.2 Семейство глутатион-S-трансфераз

полиморфизм белок глутатион экстрагирование

GST (ГСТ) (глутатион-S-трансферазы) — семейство ферментов, которые катализируют присоединение трипептида глутатиона к эндогенным или чужеродным веществам, имеющим электрофильные функциональные группы. В человеческом организме присутствует не менее 13 ГСТ ферментов, принадлежащих к пяти семействам, а именно: а (ГСТА), м (ГСТМ), п (ГСТП), с (ГСТС) и у (ГСТУ).

Помимо способности к биотрансформации ксенобиотиков, ГСТ способны осуществлять изомеризацию ПГХ (простогландин Н) в ПГД (простогландин D) это, ферменты с широкой субстратной специфичностью. Была исследована способность глутатион-S-трансфераз, выделенных из различных источников, осуществлять реакцию изомеризации ПГХ.

Воздействия окружающей среды могут также вызывать появление определенной степени риска, связанной с изменениями активности ГСТ. Например, отсутствие гена ГСТМ1 у курящих людей значительно повышает их предрасположенность к раку мочевого пузыря. Очевидно, резистентность клеток не только к нескольким алкилирующим соединениям, но и к препаратам круга Pgp-МЛУ (антрациклинам, винкристину) может быть связана с изменениями системы GSH. В клетках, характеризующихся Pgp-МЛУ, нередко обнаруживают повышение уровня ГСTn. Можно полагать, что в этих клеточных линиях наблюдается координированная регуляция генов, относящихся к разным защитным системам клетки.

Люди подвергаются воздействию множества эпоксидных цитотоксинов, мутагенов и канцерогенов, таких как бензопирен, стирен — 7,8 — оксид, афлатоксин В1. Изоформа ГСТМ1 катализирует детоксикацию этих веществ, что может служить указанием, что недостаточность этого фермента является генетическим маркером для выявления восприимчивости к раку легких что и было подтверждено. Также показано, что нуль-вариант связан с предрасположенностью к раку ободочной кишки, раку мочевого пузыря и рассматривается как фактор, определяющий предрасположенность к раку печени в результате воздействия афлатоксина В1.

У человека выделяют 3 гена ГСТ, по которым возможен полиморфизм: ГСТМ1, ГСТП1 и ГСТТ1. Для генов ГСТМ1 и ГСTT1существует альтернатива наличия или отсутствия гена. Если организм гомозиготен по отсутствующему аллелю, говорят, что он имеет «нулевой» генотип, и это означает, что данный фермент в организме не синтезируется.

1.3 Полиморфные формы белков семейства ГСТ

Гены белков ГСТM1 и ГСTT1 характеризуются делеционным полиморфизмом, влияющим на их функцию.

Ген ГСTТ1, как и ген ГСTM1, может содержать обширную делецию в структурной части, и у него также существует функционально неактивный нулевой аллель. В ряде исследований была показана связь между полиморфными вариантами данных ферментов и процессами канцерогенеза рак легкого, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, а также риском развития некоторых заболеваний например, бронхиальной астмы, эндометриоза, атеросклероза и др. — особенно в том случае, когда пациенты являются гомозиготными носителями по нулевому аллелю генотип 0/0. Этнические сравнения показали, что частота встречаемости 0/0 генотипа меньше у представителей негроидной расы (35%), чем у представителей европеоидной (49%). О возможной связи между нулевыми аллелями генов ГСTТ1 и ГСTM1 и предрасположенностью к развитию нейродегенеративных заболеваний существуют противоречивые данные[6]. Исходя из приведенных данных, можно сделать предположение, что гены ГСT, возможно, вовлечены в патогенез различных нейродегенеративных заболеваний. ГСТП1 является главной формой глутатион S-трансферазы, экспрессируемой в коже, и её активность существенно выше у лиц женского пола, чем мужского[7].

Тот или иной полиморфизм не всегда связан с проявлением функционального эффекта, т. е. он может быть «молчащим». Функциональные полиморфизмы включают:

а) точковые мутации в кодирующих районах генов, обусловливающих аминокислотные замены, в результате чего может меняться каталитическая активность, ферментативная стабильность и / или субстратная специфичность;

б) дуплицированные гены, определяющие повышенный уровень ферментов в организме;

в) полностью или частично делетированные гены, что обусловливает потерю генного продукта;

г) варианты, возникающие в результате нарушения сплайсинга, что приводит к изменению белковых продуктов.

Предполагается, что большинство генетических полиморфизмов отвечают за продукцию ферментов и других белков в пределах нормальных колебаний количественной изменчивости.

ГСTM

У человека встречается 3 аллельных варианта гена ГСTM1: ГСTM1*A и ГСTM1*B — кодирующие белки со сходной ферментативной активностью, и ГСTМ1*0 — который содержит протяженную делецию и кодирует неактивный вариант фермента, (так называемый нулевой аллель).

Результаты семейного анализа указывают на важную роль ГСTM1 в формировании восприимчивости к атопической БА, которая реализуется, по-видимому, посредством влияния на становление и функцию иммунной системы, что подтверждается положительной корреляцией числа нулевых аллелей ГСTM1 и такими показателями, как общий IgE, диаметр прик-теста и количество эозинофилов периферической крови. Полиморфизм гена, кодирующего ГСTM1 также может быть связан со случаями заболеваемости раком мочевого пузыря[8].

Показано, что «нулевой» генотип гена ГСTM1 является протективным фактором развития ЦП алкогольной и смешанной (вирусы гепатита C и B, алкоголь) этиологии. Частота «нулевого» генотипа гена ГСTM1 в объединенной группе больных ЦП (без разделения по этиологическому фактору) составляет 39.2%, у больных алкогольным циррозом — 39% и при заболевании смешанной этиологии (HCV или HBV + алкоголь) — 34.2%, что значительно ниже, чем в контрольной группе (64.6%). Выявлено, что делеционный полиморфизм гена ГСTM1 и вариант A313G гена ГСTP1 коррелируют с выживаемостью больных ЦП. Так, частота «нулевого» генотипа ГСTM1 в группе выживших больных выше (46.6%), чем в группе умерших (30.2%).

ГСТП

В гене ГСТП1 описано два диаллельных полиморфизма, связанных с влияющими на ферментативную активность кодируемых белков миссенс-мутациями Иле105Вал и Ала114Вал. Так, в результате Иле105Вал мутации происходит изменение устойчивости фермента и значительное увеличение его каталитической активности по отношению к различным органическим соединениям[10].

Изоформа Иле105Вал ассоциирована с раковыми заболеваниями. Исследование 1042 пациентов с раком легких и 1161 здоровых доноров показало значительную ассоциацию варианта 105 Вал с влиянием курения на развитие рака легких. При выкуривании 25−30 пачек в год (в среднем по группе) риск развития рака легких увеличивался в 13 раз при наличии гомозиготного варианта 105Вал. Курение также соответствовало увеличению в 3.4 раза риска рака ротовой полости при наличии гомозигот 105Вал или 114Вал.

ГСТТ

Различные фенотипы ГСTT1 могут быть охарактеризованы как «конъюгирующий» и «неконъюгирующий». Существует большое количество вариаций частоты делеций ГСTT1 (ГСTT1*0/0) у представителей различных национальностей. Индивидуальные особенности в биотрансформации и метаболизме ксенобиотиков объясняется полиморфизмом генов, кодирующих ферменты, рецепторы или транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию ферментов. Также полиморфизм некоторых генов может изменить аффинность лиганда, трансактивационную активность или экспрессию рецепторов и, таким образом, повлиять на гены-мишени.

Гомозиготность по нулевому аллелю ГСTT1 являются факторами риска развития как бронхиальной астмы, так и атопического дерматита у детей [11,12].

Также проводились многочисленные исследования по выявлению корелляции между полиморфизмом ГСТТ1 и другими видами рака. Статистически значимые различия были обнаружены в случаях с астроцитомой, менингиомой, миелоплазией, но не были подтверждены[13].

1.4 Сочетанное действие полиморфных форм ГСТ

Проведённые в 90-х годах исследования как онкологических, так и ряда других заболеваний, показали, что комбинации генотипов часто обусловливают более высокий риск, чем индивидуальный ген, т. е. имеются межгенные взаимодействия.

В ходе исследований обнаружена более высокая частота вариантных генов глутатион-S-трансфераз ГСТM1 и ГСТП1 у больных раком желудка, чем у здоровых лиц, что может свидетельствовать о более высоком риске заболевания РЖ для носителей данных генотипов, что может обусловить неодинаковую степень предрасположенности к онкологическим заболеваниям в условиях влияния токсических факторов. [6]

В качестве примера может быть использована корреляция числа нулевых аллелей гена ГСTM1 с выраженностью количественных показателей атопии у больных БА, а в работе увеличение показателей ассоциации генов ГСTM1 и ГСTT1 с атопической БА с увеличением числа нулевых аллелей этих генов. Эти данные указывают на влияние ферментов биотрансформации на функционирование иммунной системы. Каким образом реализуется это влияние, пока неизвестно.

Исследования показали, что полиморфизм генов, связанных с поддержанием уровня иммуноглобулина Е, имеет бoльшее значение для формирования клинических проявлений БА, чем в предрасположенности к ней.

Установлено наличие следующих генных взаимодействий:

· аддитивный эффект в усилении риска бронхиальной астмы и атопического дерматита для сочетания гомозиготных делеций генов ГСТM1 и ГСTT1;

· синергический эффект сочетания гомозиготной делеции гена ГСTT1 и гомозиготы по аллелю дикого типа ГСТП1;

· аддитивный защитный эффект для геторозиготных генотипов по локусам С481Т и G590A гена НAT2.

Ингибиторы активности глутатион-S-трансфераз рассматриваются как наиболее перспективные модификаторы лекарственной устойчивости. В связи с этим этакриновая кислота (обычно применявшаяся как диуретик) проходит клинические испытания в качестве препарата, преодолевающего лекарственную устойчивость, связанную с ГСХ. Бутионинсульфоксамин снижает внутриклеточный уровень глутатиона и преодолевает устойчивость клеток к алкилирующим соединениям. Бутионинсульфоксамин применяют в экспериментах в качестве препарата, влияющего на МЛУ. С ГСХ связывают результаты лечения лимфом. Повышение активности ГСТ наблюдается в устойчивых к хлорбутину случаях хронического лимфолейкоза. Экспрессию этих ферментов рассматривали как прогностический признак при ранних формах рака молочной железы[14].

2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

Объектом исследования являются образцы ДНК, фиксированный на Whataman FTA Classic Card. Для сбора и хранения биологического материала использовалась бумага, на которую раскапывалась цельная кровь, а затем высушивалась. Каждый образец хранится под уникальным идентификационным номером.

Генетический материал, экстрагированный из образцов, был подвергнут аллелеспецифическому пцр с последующей детекцией продуктов реакции.

Было исследовано влияние полиморфизма генов семейства ГСТ на риск заболеваемости различными видами рака с расчетом относительных шансов (ОШ) развития заболевания при наличии мутантного гена.

Также объектами исследования являются результаты аналогичных исследований, статьи. Нами была проведена обработка исследованных данных с последующим статистическим анализом и мета-анализом.

Для проведения статистического и мета-анализа было использовано следующее ПО: Microsoft Office Excel 2007, Stata 12.

2.2 Экстрагирование ДНК из соскоба с внутренней стороны щеки / цельной крови, фиксированных на Whatman FTA Classic Card

На практике нами был использован генетический материал, полученный из цельной крови, фиксированной на Whatman FTA Classic Card.

Данный метод фиксации образцов позволяет многократно использовать один и тот же генетический материал для нескольких пцр-реакций и позволяет хранить образцы при комнатной температуре.

Забор цельной крови проводится с применением скарификатора, не входящего в набор. При помощи скарификатора производят прокол подушечки безымянного пальца левой руки. При появлении крупной капли крови, палец несколько раз прижимают к поверхности Whatman FTA Classic Card. Затем образец высушивают при комнатной температуре. После этого готовый образец хранят при комнатной температуре в индивидуальном конверте под номером, с описанием данных донора.

Взятие соскоба с внутренней стороны щеки производится при помощи набора, содержащего индивидуальный аппликатор, упакованный в пластик (9×15 см), и помещенный в опломбированный пакет. Образец высушивают, пакеты сново пломбируют. Готовый образец можно хранить при комнатной температуре.

Приготовление образцов Из каждого фиксированного образца вырезают круглый участок диаметром 3 мм. Вырезанный участок трижды покрывают метанолсодержащим составом, затем высушивая на воздухе в первый раз при комнатной температуре в течение 20 минут, затем дважды — при температуре 37 °C в течение 40 минут. Метанол стимулирует преципитацию гема к бумаге.

С помощью щипцов высохшие образцы переносят в тонкостенные (0,2 мл) пцр-пробирки и приливают 5 µл буфера и 45 µл дист. воды. Образцы инкубируют последовательно при 60 °C в течение 30 минут; 99,9°С в течение 10 минут; 4 °C до остывания.

Перед началом инкубации добавляют протеинкиназу К (50 µг/мл), которая инактивируется при температуре 99,9°С. Это позволяет улучшит сохранность генетического материала.

2.3 Аллельспецифичная ПЦР

Для эффективного осуществления ПЦР 3'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов может отсутствовать вообще. Именно эта особенность ПЦР и лежит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфичной ПЦР, иначе называемой аллель-специфичной элонгацией праймера (allele specific primer extension).

Другой тип универсальных аллель-специфичных праймеров содержит 3'-концевой нуклеотид, всегда некомплементарный матрице, а мутантный нуклеотид матрицы попадает в его внутреннюю часть. В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает любой некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации. Такие праймеры позволяют обнаруживать любые точковые мутации в гомозиготном состоянии и у гаплоидных микроорганизмов. Для выявления гетерозиготного состояния анализируемого гена иногда используют мутантный и нормальный праймеры разных размеров, которые различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, полностью комплементарных анализируемой ДНК. В этом случае в процессе ПЦР в реакционную смесь можно одновременно добавлять оба аллель-специфичных праймера: мутантный и нормальный вместе с общим для обоих праймеров — встречным. Образовавшиеся продукты реакции, соответствующие мутантному аллелю и аллелю дикого типа, далее разделяют электрофоретически в гелях, используемых для секвенирования нуклеиновых кислот.

При использовании аллель-специфичных праймеров для обнаружения мутаций необходимо иметь в виду, что не все сочетания ошибочно спаренных с матрицей 3'-концевых нуклеотидов одинаково эффективны в блокировании ПЦР. Наименьшей способностью к элонгации праймеров с ошибочно спаренными 3'-концевыми нуклеотидами обладает так называемый фрагмент Шоффлера Taq-полимеразы, который представляет собой молекулу ДНК-полимеразы T. aquaticus, укороченную с N-конца на несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время в этом методе не применимы термостабильные ДНК-полимеразы, обладающие 3'->5'-корректирующей активностью, например Vent-полимераза[16].

Для проведения практической части было отобрано 43 пробы. Из них 23 — пациенты с диагностированным раком молочной железы (группа исследования), и 20 здоровых женщин (группа контроля).

В практической части для проведения аллелеспецифичной пцр с детекцией форм гена ГСТТ была использована реакционная смесь (20 мкл на пробу) со следующим составом:

Для приготовления пробы компоненты реакционной смеси были взяты в следующих пропорциях:

Для постановки реакции амплификации использовался ПЦР-амплификатор Primus 96 advanced GRADIENT (PEQLAB Германия). Этот амплификатор позволил подобрать оптимальную температуру отжига праймеров используемых в данной работе, благодаря функции градиента температур, устанавливаемого в необходимом температурном интервале.

Анализ проводился по двум полиморфизмам — ГСТТ1 (конъюгирующий) и ГСТТ1 0/0 (неконъюгирующий). Нами была использована методика постановки аллелеспецифического ПЦР — метод определения полиморфизма с точностью до единичного нуклеотида.

Температурный режим, выбранный для амплификации

После окончания амплификации проводилась детекция конечных продуктов реакции.

2.4 Детекция продуктов ПЦР

Детекция продуктов пцр проводится с применением вертикального и горизонтального электофореза. Большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т. е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Результаты амплификации оценивались путем проведения горизонтального электрофореза (камера и блок питания Peqlab) в 3% агарозном геле в однократном TRIS-борат-ЭДТА буфере (1xTBE).

В одну из лунок вносился маркер молекулярного веса («Праймтех», РБ), который позволяет определять молекулярный вес ампликонов.

Время проведения электрофореза зависит от молекулярной массы амплифицированного продукта. В нашем случае время электрофореза составляло в среднем 60 минут.

Анализ гелей проводился с помощью трансиллюминатора CN-1000 Darcroom (Vilbcr Lourmal, Германия) с оригинальным программным обеспечением.

Для детекции ДНК-амплификатов в ультрафиолете (л=260 нм) использовали 0,1% раствор бромистого этидия в 1xTBE. Экспозиция геля в растворе перед анализом составляла 10−12 минут. Благодаря высокочувствительной фотокамере, ассоциированной непосредственно с трансиллюминатором, возможно фотографировать и сохранять изображение для последующего его анализа.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Детекция наличия продукта в пробах

На представленных снимках (Рисунок 1) можно видеть светящиеся в ультрафиолетовом излучении полосы, означающие наличие продукта — амплификона ГСТТ1 длиной 480 пар оснований.

(a)

(b)

(c)

Рисунок 1. — Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР в ультрафиолете (л=260 нм) Всего было выявлено 28 положительных результатов по наличию конъюгирующего варианта гена ГСТТ1, и 16 отрицательных. Положительный результат означает наличие в пробе конъюгирующего типа гена ГСТТ1, отрицательный — гомозиготность исследуемого генотипа по нулевому аллелю гена ГСТТ1.

3.2 Статистическая обработка результатов практической части

Для определения вклада полиморфизма гена ГСТТ1 в заболеваемость различными видами раковых заболеваний необходимо провести статистический анализ, показывающий, являются ли различия в группе исследования и контрольной группе статистически значимыми. Для этого необходимо рассчитать значения относительных шансов, которые характеризуют риск развития заболевания у человека с данным полиморфом гена ГСТТ1, и параметра чІ, который является аналогом дисперсионного анализа для качественных признаков.

Если показатель относительных шансов, рассчитанный для группы исследования, превышает единицу, то при уровне значимости 0, 05 различия можно считать статистически значимыми, т. е. вариант гена влияет на заболеваемость.

чІ - еще один параметр, позволяющий оценить вклад полиморфа гена в заболеваемость. Распределение чІ устойчиво при суммировании, что позволяет использовать его при метаи статистическом анализе. Кроме того, этот параметр позволяет сравнивать распределения частот вне зависимости от того, распределены они нормально или нет. [18]

Сравнение двух полиморфных вариантов гена ГСТТ1 представляет собой таблицу 2×2, где ожидаемые значения окажутся завышенными, что приведет к тому, что нулевая гипотеза будет отвергнута даже при условии ее истинности. Поэтому данная нами формула приводится с поправкой Йейтса.

Таблица 1 — Соотношение количества заболевших и здоровых людей в группе исследования и группе контроля в зависимости от полиморфа ГСТТ1

Обозначения: ГСТТ1+ гомоили гетерозигота по ненулевому аллелю ГСТТ1.

ГСТТ1 - гомозигота по нулевому аллелю ГСТТ1

Исходя из показателя ОШ, который составляет 37,5 что значительно превышает единицу, даже с учетом доверительного интервала, а также показателя чІ, который также превышает табличное значение (3,841 для уровня значимости 0,05), можно сказать, что гомозиготность по ГСТТ1 (0/0) является фактором риска для развития онкозаболевний молочной железы, а носители такого генотипа входят в группу риска по данному заболеванию.

3.3 Мета-анализ исследований взаимосвязи полиморфизма ГСТТ1 с раковыми заболеваниями различной локализации

Одной из задач настоящего исследования является объединение результатов нескольких исследований для мета-анализа.

Мета-анализ, в отличие от статистического анализа и обзора данных, является более точным инструментом:

· указывает, что выборка более разнообразна, чем предполагалось исходя из разнообразия образцов

· обобщает нескольких исследований

· производит контроль разнообразия между исследованиями

· может объяснять разнообразие между данными

· увеличивает статистическую мощность

· работает в условиях избытка информации,

· обобщает несколько исследований и поэтому меньше зависит от отдельных находок, чем индивидуальные исследования

· может обнаруживать систематические ошибки Задачей проводимого нами мета-анализа является выявление разности риска возникновения заболевания в сопоставляемых выборках — исследуемая группа и контрольная группа. В ходе анализа объединяются разрозненные исследования, данный объединяются и обрабатываются. В исследуемую группу вошли пациенты со злокачественными новообразованиями различной локализации, в контрольную группу — здоровые люди, без онкопатологий.

Данная таблица (Таблица 2) показывает, что результаты, проведенные в разное время и в различных условиях, различаются. В частности, различаются значения относительных шансов и чІ для патологий с одинаковой локализацией.

Таблица 2 — Результаты исследований зависимости развития онкологических заболеваний от генотипа по гену ГСТТ1 [20 — 25]

Обозначения: ГСТТ1+ гомоили гетерозигота по ненулевому аллелю ГСТТ1.

ГСТТ1 - гомозигота по нулевому аллелю ГСТТ1

Для того, чтобы избежать излишней гетерогенности результатов, и, соответственно, трудностей при трактовке, результаты исследований были объединены по признаку локализации злокачественной опухоли. Были произведены расчеты ОШ и чІ для обобщенных данных (Таблица 3).

Таблица 3 — Мета-анализ результатов исследований зависимости развития онкологических заболеваний от генотипа по гену ГСТТ1 [21 — 25]

Обозначения: ГСТТ1+ гомоили гетерозигота по ненулевому аллелю ГСТТ1.

ГСТТ1 - гомозигота по нулевому аллелю ГСТТ1

Как видно из таблицы, мета-анализ позволяет вывести усредненные данные без потери информативности. Для уровня значимости 0,05 (вероятность ошибки составляет менее 5%) табличное значение чІ составляет 3, 841. Только значение чІ для оценки риска заболеваемости раком поджелудочной железы превышает это значение[19].

С учетом нижнего значения доверительного интервала, значение ОШ, равное единице, также превышает лишь значение, подсчитанное для рака поджелудочной железы (Диаграмма 1).

Диаграмма 1 — Сравнение параметра ОШ по различным видам рака Исходя из рассчитанных ОШ и чІ, можно сказать, что полиморфизм гена ГСТТ1 не оказывает влияния на вероятность возникновения онкопатологий мочевого пузыря и яичников, однако носительство нулевого аллеля этого гена увеличивает риск развития рака поджелудочной железы.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что люди, носители гомозиготного генотипа по нулевому аллелю ГСТТ1, входят в группу риска по раку поджелудочной железы.

Заключение

В последние годы роль генотипа в развитии онкологических и других заболеваний становится все более очевидной. Доказана роль полиморфных генов в развитии таких заболеваний, как бронхиальная астма, болезнь Альцгеймера, спектра раковых заболеваний.

В ходе проведенного нами исследования была поставлена аллелеспецифичная пцр, по результатам которой был проведен анализ встречаемости нулевого аллеля гена ГСТТ1 среди пациентов с раком молочной железы и здоровых людей — выявлена корреляция между полиморфным нулевым типом гена ГСТТ1 (генотип 0/0) и заболеваемостью раком молочной железы (ОШ — 37,5; ДИ — 35,07 — 39,93; чІ -14,73).

Также, с целью выявления возможной роли полиморфного гена ГСТТ1 В развитии других онкопатологий, был проведен обзор статей, содержащих данные распространенности полиморфных вариантов гена ГСТТ1 среди онкобольных. Данные исследований были объединены и проанализированы. По результатам мета-анализа, полиморфизм по гену ГСТТ1 влияет на риск возникновения рака поджелудочной железы (ОШ — 2,11; ДИ — 1,91 — 2,31; чІ - 57,47).

Таким образом можно говорить о том, что люди, гомозиготные по нулевому аллелю ГСТТ1 входят в группу риска по раку молочной железы и раку поджелудочной железы. Определение полиморфизмов по различным генам биотрансформации ксенобиотиков и формирование групп риска может помочь при определении предрасположенности к ряду заболеваний, что поможет спланировать профилактические меры, повысить процент заболеваний, выявленных на начальной стадии, и снизит смертностьот онкологических заболеваний.

Список использованных источников

1. Спицын, В.А., Макаров, С.В., Пай, Г. В., Бычковская, Л. С. Полиморфизм в генах человека, ассоциирующихся с биотрансформацией ксенобиотиков / Вестник ВОГиС, 2006, Том 10, № 1 Москва, Россия.

2. Christ-Hazelhof E., Nugteren D.H., Van Dorp D.A. Conversions of Prostaglandin Endoperoxides by Glutathione-S-Transferases and Serum Albumins. // Bioch. Bioph. Acta 1976, v. 450, pp. 450−461. Bioch. Bioph. Acta 1976

3. Cao K., Stack D.E., Ramanathan R., Gross M.L., Rogan E.G., Cavalieri E.L. Synthesis and structure elucidation of estrogen quinones conjugated with cysteine, N-acetylcysteine, and glutathione // Chem. Res. Toxicol. 1998. Vol. 11. P. 908−916.

4. Thier R, Brьning T, Roos PH, et al. Markers of genetic susceptibility in human environmental hygiene and toxicology: the role of selected CYP, NAT and GST genes // Int J Hyg Environ Health. 2003 Jun; 206 (3): 149−71

5. Мартов, С.И., Севостьянова, Н.В., Дмитриева, А.И. и др. Полиморфизм генов ферментов первой и второй фазы биотрансфор-мации ксенобиотиков у больных раком желудка // Мартов С. И. // Сибирский онкологический журнал, 2010, № 4 (40)

6. Fryer AA, Zhao L, Alldersea J, et al. Use of site-directed mutagenesis of allele-specific PCR primers to identify the GSTMJ A, GSTM1 B, GSTM1 A 3 and GSTM1 null polymorphisms at the glutathione S-transferase, GSTM1 locus // Biochem J 1993; 295: 313−15.

7. Lin HJ, Han CY, Bernstein DA, et al. Ethnic distribution of the glutathione transferase Mu 1−1 (GSTMI) null genotype in 1473 individuals and application to bladder cancer susceptibility // Carcinogenesis 1994; 15:1077−81.

8. Макарова, С. И. Роль полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к атопическим заболеваниям гепатотоксичности противотуберкулезной терапии: автореферат диссертации док. биол. наук: 03.02.07/С.И. Макарова; Рос. акад. естествознания — Уфа, 2011.

9. A.S. Wenzlaffl, M.L. Cote1, C.H. Bock1, et al. GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms, environmental tobacco smoke exposure and risk of lung cancer among never smokers: a population-based study // Carcinogenesis vol.26 no.2 pp. 395−401, 2005.

10. Fryer AA, Zhao L, Alldersea J, et al. Use of site-directed mutagenesis of allele-specific PCR primers to identify the GSTMJ A, GSTM1 B, GSTM1 A 3 and GSTM1 null polymorphisms at the glutathione S-transferase, GSTM1 locus // Biochem J 1993; 295: 313−15.

11. Elexpuru-Camiruaga J, Buxton N, Kandula V, et al. Susceptibility to astrocytoma and meningioma: influence of allelism at glutathione S-transferase (GSTT1 and GSTM1) and cytochrome P-450 (CYP2D6) loci // Cancer Res 1995; 55:4237−9.

12. Lin HJ, Han CY, Bernstein DA, et al. Ethnic distribution of the glutathione transferase Mu 1−1 (GSTMI) null genotype in 1473 individuals and application to bladder cancer susceptibility // Carcinogenesis 1994; 15:1077−81.

13. R. Mullin. Personalized Medicine // Chemical and engineering news, February 11, 2008 Volume 86, Number 06 pp. 17−27.

14. Raimondi S., Benhamou S., Coutelle C. et al. Association of metabolic gene polymorphisms with alcohol consumption in controls // Biomarkers. — 2004. — V. 9, № 2. — P. 180−189.

15. Satre M.A., Ћgombiж-Knight M., Duester G. The Complete structure of human class IV alcohol dehydrogenase (retinol dehydrogenase) determined from the ADH gene // J. Biol. Chem. — 1994. — V. 269, № 22. — P. 15 606−15 612.

16. Sun F., Tsuritani I., Honda R. et al. Association of genetic polymorphisms of alcohol-metabolizing enzymes with excessive alcohol consumption in Japanese men // Hum. Genet. — 1999. — V. 105, № 4. — P. 295−300.

17. Инструкция по использованию Whataman FTA Classic Card: текст по состоянию 02.05.2013 г. — http://www.whatman.com/DMPK.aspx

18. Гланц С. Медико-биологическая статистика/ С. Гланц — 4-е издание — Москва: Практика — 1999 — 462 с.

19. Cochrane Handbook for Systematic Reviews of Interventions [Электронный ресурс]. — The Cochreyn Collaboration, Version 5.1.0. — Режим доступа: http://handbook.cochrane.org/. — Дата доступа: 26.04.2013.

20. Hashemi, Eskandari-Nasab, Fazaeli et al. Association between polymorphisms of glutathione S-transferase genes (GSTM1, GSTP1 and GSTT1) and breast cancer risk in a sample Iranian population //Biomarkers Med. — 2012. — № 6. — P. 797 — 803.

21. Oliveira, Jacob Lourenc. o, Sagarra et al. Polymorphisms of glutathione S-transferase Mu 1 (GSTM1), Theta 1 (GSTT1), and Pi 1 (GSTP1) genes and epithelial ovarian cancer risk // Disease Markers — 2012. — № 33. — P. 155−159.

22. Yue Fan, Wen Zhang, Chen-Ye Shi, D. Cai. Associations of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms with pancreatic cancer risk //Springer — 2013 — 34. — P. 705 — 712.

23. Li D, TanakaM, Brunicardi FC, FisherWE, Gibbs RA, GingrasMC. Association between somatostatin receptor 5 gene polymorphisms and pancreatic cancer risk and survival // Cancer. — 2011. — № 117. — Р. 2863−2872.

24. Asim M, Khan LA, Husain SA, Husain S, et al. Genetic polymorphism of glutathione S transferases M1 and T1 in Indian patients with hepatocellular carcinoma // Disease Markers — 2010. — № 28. — Р. 369−376.

25. Iodice S, Gandini S, Maisonneuve P, Lowenfels AB. Tobacco and the risk of pancreatic cancer: a review and meta-analysis. Langenbecks Arch Surg. — 2008. — № 393. — Р. 535−545.