Введение. 
Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

туберкулез возбудитель иммуносорбент микобактерия АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулёзом в нашей стране носит характер эпидемии (Онищенко Г. Г., 2002; Пунга В. В., Капков Л. П., 1999). По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) в промежутке времени с 2000 по 2020 гг. туберкулёзом в мире заболеют около 200 млн. человек, умрут около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек (WHO Fact Sheet, 2000). В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надёжных (активных и специфических), простых в использовании и дешёвых средств для быстрого выявления возбудителя в исследуемом материале.

В нашей стране при диагностике туберкулёза большое внимание уделяется культуральным методам, за рубежом — микроскопии мазка. Но оба эти метода имеют существенные недостатки. Культивирование с момента посева составляет три месяца, причём положительных результатов- 0,5−14% (Клименко М.Т. с соавт, 1985; Клименко М. Т. с соавт., 1987; Литвинов В. И., 1996). При микроскопии мазка (флуоресцентной) наблюдается до 14% положительных результатов (Канюк А.Н., 1995). Таким образом, данные методы не могут претендовать на роль основных в лабораторной диагностике туберкулёза. Известны способы диагностики туберкулёза с помощью эритроцитарных диагностикумов (Архангельский Н.И. с соавт., 1985), реакции агрегатагглютинации (Хоменко А.Г. с соавт, 1992), реакции агглютинации латекса, масс-спектроскопии (Маякова Т.И. с соавт., 1995), но данные методы трудоёмки и малоактивны. Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому распространения ещё не получили. В связи с этим, актуальным является разработка диагностических препаратов и методов исследований, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностью и информативностью.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель исследования:

совершенствование биотехнологий иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза.

Основные задачи исследования:

• — отработать методические подходы по извлечению полноценных антиген-ных комплексов из микробных биомасс возбудителя туберкулёза и получить высокоактивные иммунные туберкулёзные сыворотки;
• — разработать магнитные сорбенты с фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов для удаления из туберкулёзных иммунных сывороток неспецифических антител;
• — отработать биотехнологию изготовления высокочувствительных и ста-бильных туберкулёзных липосомально-иммунопероксидазных конъюгатов;
• — разработать эффективные способы получения суспензионных диагности-кумов на основе полиакролеиновой (латексной) и алюмосиликатной матриц для реакций агглютинации;
• — отработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики туберкулёза в экспрессных методах (иммуноферментном анализе — ИФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе — КИФА);
• — определить диагностическую ценность применения разработанных иммунобиологических препаратов на экспериментальном и клиническом материале.

Научная новизна работы.

Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов из микобактерий туберкулёза.

Разработан и применён аффинный магносорбент при проведении иммуносорбции гетерологичных антител из иммунных туберкулёзных сывороток, позволяющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускорять и упрощать процесс сорбции.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства липосомальных туберкулёзных иммуноферментных конъюгатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью.

Разработаны приёмы по предварительному селективному концентрированию микобактерий туберкулёза и их антигенов на магноиммуносорбентах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИ-ФА), позволяющие исследовать объекты внешней среды, материал от больных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограниченного объёма пробы с низкой концентрацией микобактерий с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы.

Приоритетность ряда выполненных исследований подтверждена 2 патентами РФ на изобретения: № 2 192 265 «Способ получения комплекса фосфолипидов» (2002 г.) и № 2 195 296 «Способ получения ганглиозидов» (2002 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы. Основная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определении научно-методических аспектов разработки иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза, которые учитывают характерные особенности антигенной структуры микобактерий, свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокремнезёмы, латексы) природы, методы конъюгации лигандов и маркёров, определяя направления последовательных стадий и операций биотехнологии производства диагностических туберкулёзных препаратов.

Разработаны научно-методические приёмы по получению полноценного антигенного материала из бакмасс микобактерий, высокоактивных иммунных сывороток, удалению из них перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов. Оптимизация параметров иммобилизации антител обеспечила конструирование высокоактивных и специфических диагностических препаратов (иммуноферментных, суспензионных латексных и алюмосиликатных для реакции агглютинации, магноиммуносорбентных).

Разработанные методические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и иммуноглобулинов позволили повысить стабильность и увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.

Сконструированные туберкулёзные магноиммуносорбенты в сочетании с экспрессными методами диагностики повышают их чувствительность до 50−100 микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения анализа до 1−1,5 часов за счёт селективного концентрирования на своей поверхности микобактерий, ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов.

Результаты проведённых исследований по сочетанным методам магноиммуносорбции с экспрессными анализами и использование липосомальных препаратов дополняют новыми научными данными сведения о возможности использования иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции микобактерий туберкулёза.

Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Главным Государственным санитарным врачом России Г. Г. Онищенко 06.04.2000 г., и «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», утверждённых директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).

На Федеральном уровне утверждены зам. главного санитарного врача РФ Е. Н. Беляевым технические условия (ТУ) 9154−00−1 897 080−2004 на фосфолипиды для получения липосом (письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г.). На учрежденческом уровне утверждены два регламента: на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.2004 г.) и на тестсистему липосомально — иммунопероксидазную магноиммуносорбентную для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом, утверждённую директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ по экспресс-диагностике туберкулёза и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге микобактерий.

Основные положения, выносимые на защиту.

• 1. Научно-методические подходы к получению высококачественного биологического сырья (антигенов и антител) для производства диагностических туберкулёзных препаратов. Получены водорастворимые антигены микобак-терий, содержащие полный набор антигенных комплексов с высокой активностью (1:32—1:64 в реакции иммунодиффузии (РИД). Подобрана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами антител, основанная на оптимальной комбинации комплекса специфических антигенов и иммуномодуляторов.
• 2. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных туберкулёзных сывороток. Разработанные сорбенты с иммобилизованными гетерологичными антигенами и метод сорбции позволили за один этап получить не только высокоспецифичную сыворотку, но и сохранить её первоначальную серологическую активность.
• 3. Научно-методические основы изготовления липосомально — иммунопероксидазного конъюгата для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом. Иммобилизованные на мембране липосом фермент и туберкулёзные иммуноглобулины повышают свою стабильность, что приводит к увеличению срока годности диагностической системы.
• 4. Биотехнология производства суспензионных латексных и алюмосиликатных диагностикумов, обеспечивающая высокую эффективность обнаружения микобактерий туберкулёза в экспериментальных и клинических условиях. Разработанные препараты по чувствительности аналогичны традиционным методам, но превосходят их по простоте изготовления и экспрессности (постановка и учёт результатов реакции с алюмосиликатным диагностикумом 1 — 3 мин).
• 5. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твёрдофазных микрогранулированных аффинных магноиммуносорбентов для избирательного концентрирования микобактерий и их использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА). Разработанные препараты позволяют повысить чувствительность более чем в 1000 раз при увеличении вероятности выявления микобактерий за счёт селективного концентрирования антигена на антителе, находящемся на твёрдой матрице.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI века» (Саратов, 28−30 сентября 2004); 1-й Всероссийской конференции «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 10−11 октября, 2004); региональном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ставрополь, 17 февраля 2005); научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпид. надзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа» (Ставрополь, 14- 16 апреля 2005), на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных научных работах (2 патента на изобретение, 1 депонированная работа и 7 трудов в научных сборниках).

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Она изложена на 178 страницах, содержит 18 таблиц и 19 рисунков.

Список литературы

включает 178 отечественных и 99 зарубежных литературных источников.