Методические указания. 
Исследование молока на присутствие стафилококков, стрептококков, бактериофага и антибиотиков

Исследование молока от маститных коров. Возбудителями воспалительного процесса вымени могут быть различные микроорганизмы, в результате действия которых секреция молока отклоняется от нормы и реакция молока из слабокислой переходит в щелочную. Молоко становится солено-горьким, в нем появляются хлопья или тянущиеся нити. Позднее выделяется гнойная жидкость, иногда с неприятным запахом. Наиболее опасное поражение вымени вызывают стрептококки — Str. mastitidis, Str. agalactiae и стафилококки — Staph. aureus.

Указанные стрептококки сходны между собой. Величина кокков 0,5…1 мкм в диаметре. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, грамположительны, не образуют пигментов. На агаре формируют мелкие, слегка мутные колонии. Желатин не разжижают. При отстое молока, полученного от больных животных, на дне сосуда оседают гной, фибрин и микробные клетки. В мазках из маститного молока Str. mastitidis наблюдается в виде коротких цепочек, заключенных в лейкоцитах, Str. agalactiae — в виде небольших скоплений; встречаются и диплококки.

Золотистый стафилококк Staph. aureus, обнаруживаемый в маститном молоке, — это сферический кокк диаметром 0,8.. .0,9 мкм. Спор и капсул не образует, неподвижный. Легко окрашивается всеми анилиновыми основными красками. Грамположительный, на всех обычных питательных средах растет в виде скоплений колоний неправильной формы. Растет при оптимальной температуре 34 … 37 °C. Факультативный анаэроб при посеве штрихом на МПА растет в виде золотистого налета с блестящей поверхностью. На кровяном агаре вокруг колоний образуется выраженная зона гемолиза. Незначительно разжижает желатин. На МПБ дает равномерное помутнение. Хорошо растет на молоке, разлагает лактозу и вызывает свертывание молока. Содержит кислые протеазы, что вызывает пептонизацию сгустка.

Для распознавания маститного молока ставят каталазную, лейкоцитную и бромтимоловую пробы, проводят бактериологические и бактериоскопические исследования.

Каталазная проба: в каталазник Функе вносят 15 см³ молока, подогретого до 25 °C, и 5 см³ 1%-ного раствора пероксида водорода. Жидкости перемешивают и внутреннюю трубку каталазника Функе вставляют так, чтобы уровень жидкости был на ее нулевом делении. Каталазник ставят на водяную баню при температуре 25 °C на 2 ч. Отсчитывают высоту уровня жидкости, которая соответствует объему выделившегося кислорода. При выделении свыше 2 см³ кислорода молоко считается подозрительным на мастит.

Лейкоцитная проба: в центрифужные градуированные пробирки вносят по 10 см³ молока от каждой пробы и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 1200 об/мин. При наличии в пробирке осадка, достигающего делений 0,5…1, молоко считается подозрительным; наличие осадка, достигающего делений 1…2, указывает на то, что молоко получено от маститных коров. При микроскопии осадка такого молока обнаруживается большое количество многоядерных лейкоцитов и стрептококков.

Бромтимоловая проба. В углублениях на фарфоровой пластинке 5 капель молока смешивают с 1 каплей 0,2%-ного раствора бромтимолового синего в 60%-ном спирте. Молоко, полученное от здоровых коров, окрашивается в желтый цвет (рН 6,3 … 6,5), от маститных — в зеленый (рН 6,5 … 7,0) и даже синий (рН 7,0 … 7,5).

При тяжелых формах мастита реакция молока может быть кислой и оно окрашивается в желтый цвет.

Проба отстаивания (проба Мутовина): для проведения пробы из каждой доли вымени (соска) выдаивают 10 … 15 см³ молока в пробирки и оставляют их в штативе при температуре 4 … 8 °C. Пробирки просматривают через 2 … 3 ч и вторично через 16 … 24 ч. При этом определяют цвет молока, наличие осадка и примесей, высоту слоя сливок и их внешний вид. Маститное молоко бывает синеватым, водянистым. Слой сливок менее 0,5 мм указывает на заболевание. Признаком заболевания является также розовый цвет сливок (наличие в них эритроцитов). Хлопья указывают на большое количество лейкоцитов.

Проба с щелочью: на предметное стекло наносят 5 капель молока, добавляют 2 капли 1 н. раствора NaOH и смешивают в течение 20 с. Если молоко доброкачественное, образуется прозрачная смесь, если маститное, наблюдаются хлопья и нити.

Определение бактериофага в молоке. В настоящее время найдены бактериофаги (рис. 1), способные разрушать различные виды молочнокислых бактерий. В молоко бактериофаг попадает с бактериями, содержащимися в кормах, коже и вымени животного. Вторичное загрязнение молока бактериофагом возможно при хранении и транспортировании. На молочных заводах основным источником фага является сырье, сборное молоко, обсемененное микробами. Для исследования на наличие бактериофага пробы молока отбирают в стерильную посуду. Нагревают на водяной бане до 40 °C, добавляют 10%-ную молочную или уксусную кислоту до осаждения белков. Свернувшееся молоко фильтруют через стерильный бумажный фильтр, а затем через стерильный фильтр Зейтца. Фильтрат собирают в стерильную пробирку.

Для проведения качественной пробы на бактериофаг в опытную пробирку с 10 см³ стерильного обезжиренного молока с метиленовым синим вносят 1 петлю чувствительной культуры молочнокислого стрептококка и 1 см³ фильтрата. Контролем служит другая пробирка с 10 см³ той же среды. В нее вносят только одну бактериальную петлю чувствительной культуры. Обе пробирки помещают в термостат при 30 °C и наблюдают через 6. .8 и 24 ч. Если через 24 ч в опытной пробирке культура не вырастет (бульон прозрачный) или синий цвет молока не изменится, считают, что в фильтрате присутствует бактериофаг с сильным литическим действием; если бульон остается прозрачным через 6. .8 ч либо слегка помутнеет или молоко с метиленовым синим не изменится, а через 24 ч МПБ помутнеет, а молоко восстановится, но не свернется, то считают, что в фильтрате присутствует бактериофаг со слабым литическим действием.

В контрольной пробирке через 6 … 8 ч бульон мутнеет, метиленовый синий в молоке восстанавливается, через 24 ч наблюдается обильное помутнение бульона или восстановление и свертывание молока.

Можно использовать плотную среду. В стерильную чашку Петри наливают агар с гидролизованным молоком, после застывания подсушивают в термостате при температуре 40 … 45 °C в течение 10 … 15 мин. На поверхность среды наносят одну каплю 16 …18-часовой чувствительной культуры молочнокислого стрептококка, втирают ее шпателем Дригальского. Стерильной пипеткой у края чашки наносят каплю испытуемого фильтрата. Наклоняют чашку так, чтобы капля стекала по диаметру чашки (последнюю можно разделить на секторы и исследовать 4 … 6 фильтратов). Чашку выдерживают в термостате при 30 °C в течение 24 ч. При наличии бактериофага в фильтрате наблюдается стерильный след или стерильные пятна там, где стекла капля. Иногда по следу наблюдается слабый вторичный рост культуры.

Определение бактериофага в воздухе. Наличие бактериофага в воздухе лаборатории (цеха) устанавливают следующим образом. В стерильную чашку Петри заливают агар с гидролизованным молоком или МПА. После застывания и подсушивания агара стерильно наносят 2 капли 16 … 18-часовой бульонной чувствительной культуры молочнокислого стрептококка, распределяют шпателем Дригальского. Чашки Петри открывают на 15 … 30 мин для контакта поверхности среды с исследуемым воздухом, затем ставят в термостат на 24 … 48 ч. При наличии бактериофага в воздухе на поверхности сплошного роста культуры появляются стерильные пятна.

Определение антибиотиков в молоке. Антибиотики (пенициллин, тетрациклин, стрептомицин и др.) попадают в молоко при лечении мастита у коров. Они нарушают молочнокислое брожение. Наличие антибиотиков и моющих или дезинфицирующих средств в молоке устанавливают с использованием прямых и косвенных методов.

Прямое микроскопирование основано на подавлении размножения бактерий и изменении их формы под влиянием антибиотиков. В пробирку отбирают 10 см³ исследуемого молока, закрывают корковой пробкой и ставят на водяную баню при температуре 80 … 85 °C на 5 мин. Затем быстро охлаждают до 40 °C. маститный корова каталазный антибиотик В контрольную пробирку отбирают 10 см³ молока, которое заведомо не содержит антибиотиков. В обе пробирки добавляют по 3 … 4 капли свежей культуры чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка, выращенного на гидролизованном или обезжиренном молоке. Тщательно встряхнув закрытые пробками пробирки, ставят их на водяную баню при температуре 40 °C на 90 мин. Затем микроскопируют окрашенные препараты с иммерсионным объективом. На присутствие антибиотиков указывают резкое уменьшение количества клеток в испытуемом молоке по сравнению с контролем, наличие утолщенных форм клеток и их скопление.

Восстановление метиленового синего: в пробирки с исследуемым и контрольным молоком вносят по 1 см³ раствора метиленового синего (см. пробу на редуктазу) и затем 3…4 капли свежей культуры чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка. Встряхнув, пробирки ставят на водяную баню при температуре 38…40 °С на 5,5 ч. Следят за изменением цвета в исследуемом образце по сравнению с контролем, в котором метиленовый синий должен восстанавливаться. Наличие синего цвета в исследуемом молоке указывает на присутствие антибиотиков.

Восстановление резазурина: в пробирки с исследуемым и контрольным молоком вносят по 1 см³ раствора резазурина (см. пробу с резазурином); 3…4 капли чувствительного к антибиотикам термофильного стрептококка перемешивают и ставят на водяную баню на 45 мин. Отмечают изменение цвета исследуемого образца по сравнению с контролем. Фиолетово-розовый или сине-стальной цвет молока указывает на присутствие антибиотиков.

Восстановление комбинированного индикатора: для приготовления комбинированного индикатора 50 г хлорфенилового красного и 15 мг бромкрезолового зеленого растворяют в 100 см³ дистиллированной воды при нагревании в кипящей бане. Осадок отфильтровывают. Исследуемое и контрольное молоко в пробирках выдерживают 5 мин при температуре 80…85°С, охлаждают до 45 °C, добавляют 0,5 см³ комбинированного индикатора и 1 см³ свежей 16…18-часовой, чувствительной к антибиотикам культуры — термофильного стрептококка, разведенной водой в соотношении 1:1. Пробирки ставят на водяную баню на 60…90 мин при температуре 45 °C. Сравнивают цвет опытного и контрольного молока. Контрольный образец будет иметь зеленовато-желтый цвет.

На присутствие антибиотиков или других термостойких ингибиторов указывает серовато-голубой цвет исследуемого молока.