Иммунофенотипирование лимфоцитов иммуноферментным методом

Принцип метода. При применении реагентов фирмы Dako используется сродство стрептавидина к биотину. Фиксированные мазки крови обрабатывают мАТ к к соответствующему CD-антигену, а несвязывающиеся антитела удаляют промыванием. На следующем этапе мазки обрабатывают антителами к мАТ (против мышиного иммуноглобулина) меченные биотином. После чего добавляют стрептавидин, меченый ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой). Выявляют активность фермента субстратхромогенной смесью. При микроскопии вокруг клеток, связавших антитела, имеется ореол окрашенного хромогена. Контроли включают отрицательный образец необработанный мАТ и положительный — клетки с известным фенотипом. В качестве положительного контроля применяют антитела к CD45 (положительны все лимфоциты), а в качестве отрицательного — неиммунный мышиный IgG1 вместо мАТ. Метод не нашел широкого применения. Использование фиксированных мазков с клетками не является оптимальным, т.к. клетки могут терять некоторые молекулы при фиксации. лимфоцит фенотипирование фагоцитоз иммунный Иммуномагнитное выделение лимфоцитов как метод их фенотипирования Согласно рекламному проспекту Фирма Dynal (Норвегия) предлагает метод иммунофенотипирования лимфоцитов на основе их биомагнитного сепарирования и подсчета абсолютного количества. Принцип метода заключается в том, что парамагнитные полистерольные микрочастицы (диаметр 4,5 мкм), конъюгированные с моноклональными антителами к CD4 и CD8 антигенам, связываются с клетками, имеющими эти антигены и после 10 мин инкубации осаждаются на магнитном сепараторе, а несвязавшиеся — удаляются. В итоге подсчитывается количество клеток, связавшихся с микрочастицами.

Это один из методов, в котором мАТ связаны с достаточно крупными микрочастицами, которые взаимодействуют с клетками. Способ конъюгации антител с частицами не описывается. Этапы выделения CD4+, CD8± лимфоцитов:

• — цельную кровь разбавляют фосфатным буфером (125 мл крови + 350 мкл буфера)
• — удаляют моноциты, для чего к крови добавляют 25 мкл анти-CD14 частиц (Dynabeads), инкубируют 10 мин при магнитном сепараторе, а затем отсасывают надосадочную жидкость (НЖ) с лимфоцитами
• — к двум разным порциям НЖ без моноцитов добавляют по 25 мкл анти-CD4 и на магнитном сепараторе Dynal MPC лимфоциты, связавшие осажденные клетки, ресуспензируют в лизирующем растворе уксусной кислоты для разрушения эритроцитов (5 мкм при комнатной температуре)
• — добавляют красители (генцианвиолет или акридиновый оранжевый) и подсчитывают количество клеток в камере Горяева на световом или флуоресцентном микроскопе. Корреляция с проточной цитометрией — 90%.

Данный метод наиболее близок разработанному нами методу CD-частиц, так как микрочастицы несут антитела. Стоимость дозы магнитных частиц для одного анализа составляет 3 долл. Метод ограничен анализом CD8+ и CD4±лимфоцитов.

Лимфоцитотоксический тест Принцип метода. При связывании антител с антигенами на поверхности клетки образуется иммунный комплекс, который активирует комплемент, лизирующий клетку. Лизис оценивается по окраске клеток трипановым синим. В методе используются только те изотипы мАТ, которые способны после связывания с антигеном активировать добавленный комплемент. Рассчитывается процент окрышенных погибших клеток, который отражает количество Тили В-лимфоцитов соответствующей субпопуляции. В настоящее время метод чаще применяется для выявления HLAантигенов.

Характеристика связывания липополисахаридов бактерий лейкоцитами для оценки иммунного статуса В норме клетки СИ постоянно контактируют с бактериями в миндалинах, пейеровых бляшках, других структурах мукозоассоциированной лимфоидной ткани. Важнейшими структурами бактериальной стенки и активаторами СИ служат липополисахариды (ЛПС). Центральная часть ЛПС (ядро) — олигосахаридный «кор» состоит из остатков 2-кето-3- дезоксиоктоната, галактозы, глюкозы, гептозы и N-ацетилглюкозамина. С одной стороны, к этому ядру присоединен липид А, а с другой стороны — О-специфические полисахаридные цепочки из 3−4 сахаров, которые являются наиболее иммуногенными в ЛПС и определяют его специфичность.

В целом ЛПС является эндотоксином и уже в небольших дозах вызывает лихорадку из-за активации макрофагов и выделения ими ИЛ1, ФНОa и других цитокинов, поликлональную тимуснезависимую активацию В-лимфоцитов и синтез антител, дегрануляцию гранулоцитов, агрегацию тромбоцитов. Он может связываться с любыми клетками организма, но особенно с макрофагами. В больших дозах угнетает фагоцитоз, вызывает токсикоз, нарушение функции сердечно-сосудистой системы, тромбозы, эндотоксиновый шок. ЛПС некоторых бактерий входит в состав иммуностимуляторов (продигиозан, пирогенал).

В сыворотке крови имеется ЛПС-связывающий белок; ЛПС комплексируется с ним, а затем связывается с CD14-рецептором моноцитов макрофагов и активирует их. CD14 имеется также на В-лимфоцитах и, видимо, на всех лейкоцитах. Суперактивация лейкоцитов через этот рецептор приводит к развитию эндотоксинового шока. Блокировка этого рецептора используется в лечении. ЛПС-активированная сыворотка (комплекс ЛПС+белок) индуцирует экспрессию функционального активного рецептора для ИЛ-8 на нейтрофилах и усиливает их миграцию.

ЛПС и пептидогликан бактерий имеют связующие рецепторы на всех лейкоцитах. Лейкоциты новорожденных слабее связывают ЛПС, чем взрослых. Причем не только через CD14 рецептор, так как имеются другие структуры. В прямом связывании ЛПС участвуют Toll-рецепторы [TLR-1−11].

ЛПС является митогеном для В-лимфоцитов и может служить суперантигеном. Более того, оказалось, что он может стимулировать пролиферацию отдельных Т-лимфоцитов (1:1000) продукцию ими цитокинов. При местном контакте со слизистой оболочкой носа ЛПС в дозах 0,001−1 мкг/мл через 24 часа активировал CD3 Т-клетки и секрецию цитокинов и ферментов, т. е. индуцировал местное воспаление.

Однако, во всех цитированных работах изучалось связывание с лейкоцитами свободного ЛПС, но не изучено связывание ассоциированного на частицах. Оценка связывания ЛПС лейкоцитами и, в частности лимфоцитов, может служить интегральным показателем состояния СИ, так как при этом оценивается состояние их рецепторного аппарата.

Для приготовления ЛПС-диагностикума — частиц мы к 1 мл эритроцитов, фиксированных и активированных 2,5% раствором глютарового альдегида, добавляли 5 мл 0,01% раствора ЛПС (S. flexneri) и инкубировали 30 мин при 37 °C. Затем эритроциты отмывали 2 раза фосфатным буфером и использовали в качестве диагностикума в реакции розеткообразования с суспензией лейкоцитов крови здоровых и больных.

Уровень ЛПС±лимфоцитов у здоровых лиц был высоким — 51,4±8,6%, что указывает на то, что его связывали не только В-лимфоциты для которых он служит митогеном, но и Т-клетки.

Уровень лимфоцитов, несущих рецепторы к липополисахариду бактериальной стенки, — является интегральным показателем состояния функции защиты системы иммунитета от бактериальной инфекции. Имеется связь содержания ЛПС±лимфоцитов с длительностью клинических симптомов заболевания. При выздоровлении их относительное количество в крови составляло 40−56%. Оно достоверно не уменьшалось при атопической бронхиальной астме и других аллергических заболеваниях. В остром периоде заболеваний, ассоциированных с инфекцией, характерно было их снижение до 30- 36%, которое в периоде реконвалесценции возвращалось к норме. При рецидивирующих тяжелых гнойно-септических заболеваниях снижение может достигать 22−30% и длительно сохраняется в периоде ремиссии (рис. 1).

Следовательно, определение уровня ЛПС± лимфоцитов позволяет оценить состояние рецепторов врожденного иммунитета, снижение их экспрессии указывает на инфекцию и имеет прогностическое значение.