Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Дальнейшая работа была сосредоточена на двухфазной динамике внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах, связанной с быстрым действием ТШ (43°C, 10 мин), зарегистрированной с помощью проточной цитометрии.

В серии экспериментов было выявлено, что при снижении температуры воздействия резкое увеличение внутриклеточного уровня HSP70 после окончания ТШ также выявляется, но изменяется его амплитуда.

Так, инкубация нейтрофилов при снижении температуры на 1 °C (42°C, 10 мин) приводит к значительному меньшему возрастанию HSP70 по сравнению с инкубацией при 43 °C.

Значительная разница в динамике внутриклеточного уровня HSP70 была найдена при использовании двух способов пермеабилизации нейтрофилов. Модифицированная методика, с помощью которой были получены вышеописанные результаты, основана на добавлении тритона X-100 в качестве детергента, в то время как коммерческий набор Cytofix Cytoperm (Becton Dickinson, США) включает в качестве детергента сапонин.

Как видно из рисунка, при пермеабилизации нейтрофилов сапонином двухфазная динамика c быстрым возрастанием и падением уровня внутриклеточных HSP70 в течение 15−30 мин после завершения ТШ выявляется, но со значительно меньшей амплитудой по сравнению с результатами, полученными при пермеабилизации тритоном Х-100. В то же время, независимо от способа пермеабилизации клеток, ярко выраженного увеличения внутриклеточного уровня HSP70 и Hsp70 с учетом времени восстановления на более поздних этапах зарегистрировать не удалось.

Можно предположить, что быстрое увеличение внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах после ТШ связано со стрессиндуцированным синтезом этих белков. Чтобы установить, связано ли зарегистрированное увеличение уровня HSP70 в нейтрофилах с процессом активации трансляции, была проведена серия экспериментов с использованием ингибитора белкового синтеза циклогексимида. Предварительная инкубация нейтрофилов с циклогексимидом не приводила к ингибированию фазы увеличения детектируемых внутриклеточных HSP70 после тепловой обработки. Эти данные указывают на то, что увеличение уровня HSP70 сразу после проведения ТШ не связано с синтезом белка de novo.

Для проверки полученных методом проточной цитометрии данных об увеличении уровня внутриклеточных HSP70 после ТШ было проанализировано содержание в нейтрофилах HSP70 методом Вестернблоттинга. Нам не удалось зарегистрировать увеличение количества HSP70 после ТШ. Это свидетельствует о том, что увеличение содержания HSP70 в нейтрофилах сразу после термического воздействия не связано с усилением синтеза этих белков.

Необходимо было выяснить, с какой формой белка связано индуцированное ТШ двухфазное изменение внутриклеточного уровня HSP70. С этой целью динамика содержания HSP70 в нейтрофилах была проанализирована с использованием двух коммерческих антител, распознающих либо индуцируемый (Hsp70), либо конститутивный (Hsc70) белки HSP70. Зависимость внутриклеточного уровня этих белков от времени оказалась сходной для указанных типов антител.

Как и с использованием антител BRM22, с помощью антител к Hsp70 и Hsc70 были выявлены связанные с ТШ фазы увеличения и последующего cнижения уровня HSP70. Таким образом, вклад в зарегистрированный методом проточной цитометрии двухфазный профиль динамики вносили как конститутивный, так и индуцируемый белки HSP70.

Поскольку ранее было продемонстрировано, что увеличение уровня HSP70 после ТШ не связано с синтезом белка de novo, то можно предположить, что оно может быть связано с изменением молекулярной конформации молекулы HSP70.

Внутриклеточное содержание HSP70 было проанализировано с помощью панели из шести моноклональных антител к HSP70, полученных нами ранее [Ветчинин и др., 2010 а, б]. Предварительно, также было показано, что антитела клеточных клонов гибридом 2Е4, 2Е11, 2F3 обладают специфичностью к консервативным эпитопам субстрат-связывающего СOOH-терминального домена HSP70. Антитела гибридом 6G2, 2E5, 3C5 специфичны к участку молекулы Hsp70 консервативного NH2-терминального домена с АТФ-азной активностью [Бойко и др., 2014]. Сравнительный анализ взаимодействия моноклональных антител, специфичных к С-фрагменту HSP70, и моноклональных антител, специфичных к N-фрагменту Hsp70, показал, что динамика уровня внутриклеточных белков HSP70 в ответ на ТШ, зарегистрированная методом проточной цитометрии, для указанных групп гибридом различна. С помощью антител 6G2, 2E5, 3C5 не удалось выявить фазу увеличения внутриклеточного уровня HSP70 сразу после окончания ТШ, в то же время антитела 2E4, 2E11, 2F3 позволили это увеличение зарегистрировать.

Таким образом, индуцируемое тепловой обработкой возрастание внутриклеточного уровня HSP70, по-видимому, опосредовано усилением доступности эпитопов субстрат-связывающего домена белка специфичными к этому домену антителами.

В пользу сделанного нами заключения о конформационных изменениях белков HSP70 свидетельствуют данные следующего эксперимента, в котором образцы с нейтрофилами подвергали тепловой обработке 43 °C, 10 мин (ТШ1 и ТШ2), с периодом восстановления клеток (инкубация 37 °C, 2 ч, 5% СО2) между ТШ1 и ТШ2. Двухфазная динамика внутриклеточного уровня HSP70 в ответ на ТШ1 и ТШ2 оказалась сходной.

Таким образом, обобщая данные, можно сделать вывод, что повышение внутриклеточного уровня HSP70, вызванное ТШ, связано с изменением конформации белков, что, по-видимому, обусловлено частичной диссоциацией субстрата из комплекса с HSP70. С этой точки зрения данный параметр косвенно может указывать на количество белков HSP70, взаимодействующих с измененными белками, нуждающимися в стабилизации белками-шаперонами.