Почвенные и водные бактерии-деструкторы полигидроксиалканоатов

• Введение
• Глава 1. Обзор литературы
• 1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов
• 1.2 Области применения полигидроксиалканоатов
• 1.3 Биодеградация полигидроксиалканоатов
• 1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов
• Глава 2. Объекты и методы исследования
• 2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде
• 2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве
• 2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария
• 2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны лиственницы
• 2.3 Определение способности бактерий к биодеградации
• 2.4 Методы идентификации микроорганизмов
• Глава 3. Результаты исследования
• 3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы
• 3.2 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксивалерата в пресной воде
• Заключение
• Список используемых источников
• Приложения

Одним из решений экологической проблемы утилизации и переработки полимерных отходов является получение биоразлагаемых материалов. Возможность получения полимеров, сохраняющих эксплуатационные характеристики в период потребления, а затем разлагающихся под воздействием природных факторов на углекислый газ, воду, гуминовые вещества и биомассу. Перспективными полимерами данного типа являются полигидроксиалканоаты (ПГА). Это группа полиэфиров, синтезируемых многими бактериями в качестве источника внутриклеточного углерода и запасаемого источника энергии [1,7].

Биологическая деградация ПГА осуществляется под воздействием ферментов-деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, которые используют растворимые продукты расщепления полимеров в качестве субстрата для роста. Выявлено, что факторами, наиболее воздействующими на биоразрушаемость данных полимеров, являются концентрация микроорганизмов-деструкторов, их видовой состав, физико-химические факторы среды, а также состав и свойства полимеров [3,4,24].

Среди эффективных деструкторов ПГА — разнообразные бактерии, относящиеся к широко распространенным почвенным и водным представителям (Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Streptomyces, Ilyobacter) [2,3].

Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. С ростом перспектив применения ПГА все большую актуальность приобретает исследование закономерностей разрушаемости ПГА в естественных природных условиях. Тем более что результаты по биоразрушаемости ПГА в лабораторных условиях с использованием чистых микробных культур, выделенных из природных источников, а также под воздействием деполимеризующих ферментов, не позволяют предвидеть картину разрушения данного биопластика в природной среде, в многокомпонентных и разнообразных естественных экосистемах [10,21].

В связи с этим цель настоящей работы — идентификация бактерий-деструкторов полигидроксиалканоатов, выделенных из пресной воды тропических искусственных водоемов и бактериальной микрофлоры почвы дендрария, участвующей в деструкции ПГА.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить общее микробное число и численность бактерий-деструкторов в почве.

2. Выявить биодеструктивные способности изолятов бактерий, доминирующих в пресноводных и почвенных микробиоценозах.

3. Изучить культуральные, морфологические, физиолого-биохимические свойства бактерий-биодеструкторов для их идентификации.

Работа выполнялась на базовой кафедре биотехнологии ИФБиБТ.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов

Полигидроксиалканоаты (ПГА) являются запасными веществами в клетках бактерий. Они аккумулируются внутриклеточно в форме включений (гранул) и их масса может составлять до 90% от сухого веса клетки [4,5].

Мономерное строение полигидроксиалканоатов зависит от видовой специфики, условий роста и, особенно источника углерода в среде. Классифицируют ПГА по числу атомов углерода в мономере. Они могут быть короткоцепочечными (ПГАсцл, содержат 3−5 атомов углерода), среднецепочечными (ПГАмцл, 6−15 углеродных атомов) и длинноцепочечными (ПГАлцл, содержат более 15 атомов углерода). Многие бактерии могут одновременно синтезировать ПГАсцл и ПГАмцл, то есть являются гетерогенными.

Наиболее изученными из полигидроксиалканоатов являются полигидроксибутират и его сополимеры с оксивалериановой кислотой.

Полигидроксибутират (ПГБ) способны накапливать различные прокариотные микроорганизмы. Способность синтезировать данный полимер показана для бактерий родов: Azotobacter, Pseudomonas, Spirillum, Bacillus, Nocardia, Alcaligenes, Chloroflexus и других (всего известно около 100) [4, 15].

Накапливается полигидроксибутират в клетках в виде гранул, которые образованы плотно упакованными тяжами, ограниченными фосфолипидными оболочками с включенными в них белками. По физическим свойствам ПГБ близок к полипропилену. Однако чистый ПГБ характеризуется очень низким растяжением на разрыв, а так же более высокой температурой стеклования, чем полипропилен. Как и все полигидроксиалканоаты он устойчив к воздействию УФ излучения, но малоустойчив к растворителям, кислотам и щелочам. ПГБ нерастворим в воде и относительно устойчив к гидролитическому разложению, это отличает полигидроксибутират, как и прочие ПГА, от других биоразрушаемых пластиков, используемых в настоящее время. ПГБ подвергается растворению хлороформом и другими хлорпроизводными углеводородов [4, 5, 36].

Полигидроксибутират (ПГБ) — гомополимер D (-) — 3-в-оксимасляной кислоты. Он представляет собой изотактический полиэфир с регулярными, повторяющими единицами (C₄H₆O₂). Его формула выглядит следующим образом:

Величина n определяется условиями синтеза полимера микробными клетками, а также методами его экстракции, молекулярный вес колеблется от 60 000 до 250 000.

У полигидроксибутирата, аналогично многим полимерным материалам, температура, при которой происходит его деформация, ниже температуры кипения (температурной деградации), поэтому газовое состояние в полимерах не реализуется и основным видом фазового равновесия в них является конденсированное состояние — кристаллическое, стеклообразное, вязко-текучее и жидкое.

Субстратом для синтеза ПГБ могут служить сахара, спирты, ацетат, водород, органические кислоты. В настоящее время, с развитием технологий и увеличением объема наших знаний, появилась возможность получать полигидроксибутират и его сополимеры, используя широкий спектр исходных веществ, в том числе из промышленных отходов [4, 7].

Гетерополигидроксибутират (ПГБВ) — наиболее известный гетеро-полимерный ПГА, являющийся продуктом сополимеризации 3-оксимасляной и 3-оксивалериановой кислот. Он имеет следующую структурную формулу:

В зависимости от соотношения мономеров в полимере и их природы свойства полимерных материалов изменяются, в т. ч. механическая прочность, температура плавления, биоградируемость [4, 46,55].

Производство других полигидроксиалканоатов зависит от субстрата, на котором выращивали микроорганизмы и от специфичности синтетаз.

Биосинтез полимеров определяется тремя ключевыми ферментами: в-кетотиолаза, ацетоацетил-CoA-редуктаза и ПГА-синтаза кодируемые 25 генами, которые можно клонировать и, благодаря чему создавать новые виды или увеличивать количество необходимых [37,45].

Несмотря на то, что ПГА являются гидрофобными, частично кристаллизованными полимерами, они могут подвергаться деградации различными микроорганизмами, которые выделяют ПГА деполимеразы, разрушающие полимеры [22,26,51].

1.2 Области применения полигидроксиалканоатов

ПГА, как уже было отмечено ранее, по ряду физико-химических свойств сходны с широко применяемыми и выпускаемыми в огромных количествах и неразрушаемыми в природной среде синтетическими полимерами типа полипропилена. Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности и изменения прочности. При нагревании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов получать из этих полимеров разнообразные изделия. Масштабы применения ПГА в настоящее время сдерживаются достаточно высокой стоимостью, тем не менее сферы их применения постоянно расширяются. [18, 42]

Полигидроксибутират и его сополимеры с валератом используют для получения термоплавких адгезивных материалов, а длинноцепочечные ПГА используют в качестве адгезивов, устойчивых при прессовании. ПГА можно использовать также для замены нефтехимических полимеров в качестве тонеров и проявителей, а также ион-проводящих полимеров. [31, 50, 25, 48, 49]

Из ПГА возможно получение гибких пленок различной толщины, в том числе полупроницаемых мембран, нитей, нетканых материалов, различных полых форм (бутылки, контейнеры, коробки и пр.), а также гелей и клеев. Совокупность свойств, характерных для ПГА, делает их перспективными для применения в различных сферах — медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, радиоэлектронике и других сферах. ПГА активно исследуются с целью переработки в США, Скандинавии и Германии и Голландии. Большой интерес к биодеградируемым ПГА в настоящее время сформировался в США. [18, 42]

Безусловные перспективы и широкий рынок изделий из ПГА наметился в косметологии — это получаемые экструзией различной формы флаконы, банки, бутылки, контейнеры и коробки. Первой бутылкой из ПГА для шампуня стала использовать компания «Wella AG» в Германии. [57]

Отдельные типы ПГА образуют прочные гелии и латексы, поэтому на их основе возможно изготовление клеев, наполнителей, в том числе для стабилизации красителей. Ламинаты ПГА с бумагой и другими полимерами хорошо зарекомендовала себя для изготовления мешков и пакето для хранения разрушаемого мусора, а также одноразовой посуды. Помимо упаковочной тары, контейнеров для пищи и одноразовой посуды, ПГА используют также в качестве пищевых добавок, например, заменителя сливок, средств доставки ароматизаторов и отдушек. [58,59]

Данный материал исследуется и внедряется в различные сферы, включая необычные, например использование в условиях морской воды. Это направление возникло после того, как стало известно, что ПГА достаточно прочны, но при этом хорошо разрушаются не только в почве, но и в морской воде. Моножильные крученые нити из сополимерных ПГА используются для изготовления рыболовных сетей, крабовых ловушек, канатов, а также в практике морской аквакультуры. [28, 52]

Рынок существует и по отношению к продуктам деполимеризации и гидролиза ПГА. Из этих полимеров возможно получение спектра оптически чистых многофункциональных гидроксикислот. [34]

Новое открывающееся направление перспективности ПГА — это получение биотоплива. Недавно показано, что метиловые эфиры 3-гидроксибутирата и среднецепочечных ПГА, полученные этерификацией П3ГБ и среднецепочечных ПГА, могут быть использованы как биотопливо. Температура сгорания этих соединений порядка 20−30 кДж/г, что сопоставимо с температурой сгорания этанола (27кДж/г). По предварительным оценкам, стоимость биотоплива на основе ПГА может составить порядка 1200 дол. США за тонну. [43]

Сегодня существует рынок изделий из ПГА сельскохозяйственного назначения — это пленочная продукция для упаковки продуктов, удобрений, для тепличных хозяйств; горшечная продукция; сетки, канаты и др. В этой связи новым и экологически значимым направлением применения ПГА может стать его использование для депонирования и доставки сельскохозяйственных препаратов. Бурное развитие химии и переход сельского хозяйства на интенсивные технологии привели к появлению и применению огромного разнообразия химических веществ для борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями болезней культивируемых видов. Используемые в виде порошков, суспензий и эмульсий, пестициды зачастую не обеспечивают адресную доставку препаратов, что ведет к их рассеиванию и последующей аккумуляции в биосфере. Это вызывает необходимость поиска более эффективных средств и методов защиты полезной биоты, не оказывающих отрицательного воздействия на человека и окружающую среду в целом. [43, 11, 20]

Новым направлением исследований, ориентированных на снижение риска неконтролируемых распространения и аккумуляции ксенобиотиков в биосфере, является разработка экологически безопасных препаратов нового поколения с адресным и контролируемым выходом активного начала за счет использования специальных покрытий или матриксов из биоразрушаемых материалов. Описаны не многочисленные примеры использования полимерных носителей: этилцеллюлозы, полиуретана, альгината натрия, полимеров с памятью формы для депонирования отдельных ядохимикатов. [33, 11, 44, 53]

1.3 Биодеградация полигидроксиалканоатов

Способность ПГА к разложению в биологических средах до безвредных продуктов является одним из главных преимуществ, отличающий этот класс соединений от небиоразрушаемых пластиков. ПГА подвергаются биодеструкции как в экосистемах (в почве, водной среде), так и внутри организма. Скорость процесса может сильно варьировать, однако можно выделить несколько основных факторов, влияющих на биологическую деструкцию ПГА и их сополимеров:

· стереоконфигурация полимера (только эфирные соединения мономеров R-конфигурации гидролизуются микробными деполимеразами);

· степень кристалличности полимера (скорость деградации более кристалличных образцов ниже);

· молекулярная масса полимера (чем ниже молекулярная масса ПГА, тем быстрее происходит разложение);

· состав полимеров [24,27].

бактерия деструктор полигидроксиалканоат микрофлора Наиболее изучаемым аспектом биодеградации ПГА является способность микроорганизмов использовать данные полимеры в качестве субстратов для роста. ПГА могут разрушаться как внутриклеточно внутриклеточными деполимеразами в период аккумулятивной фазы при отсутствии стабильного источника углерода, так и внеклеточно под влиянием внеклеточных деполимераз. Бактерии, секретирующие полимер после его выделения в среду гибнут. Внутриклеточные ПГА деполимеразы не гидролизуют внеклеточные полигидроксиалканоаты, а внеклеточные деполимеразы не могут разрушать внутриклеточные гранулы, что определяется различиями в физической структуре внутриклеточных «нативных» и внеклеточных «денатурированных» гранул ПГА. Последние являются высоко кристаллизованными полимерами. ПГА нативных гранул полностью аморфны и имеют поверхностный слой, состоящий из протеинов и фосфолипидов. Поверхностный слой постепенно разрушается при выделении гранул или под действием других физических и химических факторов. Структуру и состав слоя изучают биохимически, с помощью молекулярной биологии и электронной микроскопии. Когда поверхностный слой гранул разрушен в течение процесса выделения, полимер агрегируется. Кристаллизованные ПГА не связываются с внутриклеточными ПГА-мобилизованными системами [4, 15,14,51].

В литературе изучена динамика разрушения сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата, с различной величиной включения последнего и установлено, что сополимерные образцы разрушаются быстрее.

Полигидроксиалканоаты могут разрушаться под воздействием высоких температур (свыше 300^оС), в результате кислотного и щелочного гидролиза, а также биологическим путем.

При термальном разложении происходит случайное разделение полимера. Под влиянием кислот или щелочей полигидроксиалканоаты разлагаются, как обычные эфиры. В разбавленных растворах процесс химического гидролиза полигидроксиалканоатов протекает крайне медленно, но увеличивается при высоких температурах. Биологическая деградация ПГА происходит гидролитически под воздействием специфических ферментов — деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, а также ферментами крови и тканей высших животных.

В естественных условиях ПГА разрушаются до конечных продуктов — диоксида углерода и воды в аэробных условиях, метана в анаэробных, причем процесс происходит довольно быстро. ПГА главным образом разрушаются за счет деятельности микроорганизмов [27,21].

Разрушение полиоксибутирата и сополимера ПГБ/ПГВ (с 10 мол. % гидроксивалерата) изучено при различной температуре (от 15 до 40 ^оС) в почве. Скорость деградации полимера варьировала от 0,03% до 0,64% в сутки в зависимости от типа почвы, химического состава полимера и температуры. В основном, с увеличением температуры скорость деструкции возрастала. При исследовании биодеградации ПГБ в почвенном компосте при температуре 24 и 46^оС наилучшие показатели деградации зафиксированы при 46^°С.

Области применения ПГА в связи с его уникальными свойствами различны. ПГА с успехом может быть применен в качестве матрицы для получения лекарственных форм пролонгированного действия. На основе ПГА существует возможность создания макромолекулярных терапевтических систем — матриц и резервуарных мембран и микросфер для контролируемой доставки лекарственных веществ в организм широкого спектра применения (диабетические средства, антагонисты наркотиков, антиалкогольные средства и противоопухолевые препараты) [3,4].

В число применений ПГА входят биоразлагаемые упаковочные материалы и формованные товары, нетканые материалы, одноразовые салфетки и предметы личной гигиены, пленки и волокна, связывающие вещества и покрытия, связующие материалы для металлических и керамических порошков, водоотталкивающие покрытия для бумаги и картона [7,8].

1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов

Важным вопросом, решение которого необходимо для понимания закономерностей и механизма биоразрушения ПГА, является выявление и идентификация микроорганизмов-деструкторов этих полимеров. Среди деструкторов ПГА описаны представители бактерий разных родов: Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Rhodococcus, Rhodocyclus, Syntrophomonas, Ilyobacter, Terrabacter, Terracoccus, Brevibacillus, Agrobacterium, Duganella, Ralstonia, Gracilibacillus, Enterobacter, Matsuebacter, Rhodoferax, Variovorax и Acinetobacter, Azospirillum, Mycobacterium и Streptomyces и др. [29,54,40,13,6].

При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства — характерные особенности бактерий на плотных и жидких питательных средах. Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию. Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем, присущих отдельным группам бактерий, а так же включений. Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их клеточных стенок. Изучение физиолого-биохимических свойств включает установление способа питания и типа энергетического метаболизма исследуемых культур. Важно определить такие признаки, как отношение бактерий к молекулярному кислороду, температуре, pH среды, солености, освещенности и другим факторам среды. В данную группу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов [12, 9].

Наиболее активными деструкторами ПГА признаны грибы, включая Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, Zygomycetes, Mixomycetes, Penicillium, Fusarium [38,16,32]. Более высокий деградационный потенциал грибов связывают с большей подвижностью грибных ПГА-деполимераз по сравнению с ПГА-деполимерами, экскретируемыми бактериями.

Авторы более ранних работ показали, что в изучаемых условиях в почве преобладают деструкторы короткоцепочечных ПГА, тогда как численность микроорганизмов, расщепляющих среднецепочечные ПГА невелика, от 0,8 до 18% от обнаруженных деструкторов [41,54].

Следует отметить, что при выявлении деструкторов ПГА анализируют среды (почва, компост, вода), в которых экспонировали образцы полимеров, и микроорганизмы, выделенные из пленок обрастания на поверхности полимеров, высевая их на стандартные микробиологические среды. При этом среди анализируемых микроорганизмов могут присутствовать организмы-комменсалы, утилизирующие мономеры и другие продукты разрушения высокомолекулярных ПГА, которые появляются в среде благодаря жизнедеятельности первичных и истинных ПГА-деструкторов. Для выделения истинных деструкторов ПГА необходимо использовать метод прозрачных зон, который предусматривает высев проб на минеральный агар, содержащий в качестве единственного источника углерода ПГА. Рост на такой среде микроорганизмов, обладающих ПГА-деполимеразной активностью, сопровождается образованием вокруг колоний на поверхности агаризованной среды характерных прозрачных зон как результат разрушения полимера.

Среди морских микроорганизмов-деструкторов ПГА идентифицированы бактерии Pseudoalteromonas sp. NRRL B-30 083, Marinobacter sp, NK-1, Alcaligenes faecalis AE122, актиномицеты Nocardiopsis aegyptia, Streptomyces sp. SNG9; доказана их способность секретировать экзодеполимеразы и утилизировать гомогенный П3ГБ и сополимеры П3ГБ/3ГВ. [30, 32, 54, 56]

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде

Объектом исследования в настоящей работе были пресноводные тропические бактерии, обладающие способностью к биодеградации ПГА.

Материалом для исследования служили образцы полигидроксиалканоатов (ПГА) двух типов — гомополимера 3гидроксимасляной кислоты (П3ГБ) и сополимера 3-гидроксимасляной и 3гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ), имеющие близкие физико-химические свойства. Образцы помещали в чехлы из мелкоячеистого мельничного газа и погружали на глубину 0,3−0,5 м в искусственный водоем на климатической испытательной станции (г. Нячанг, Вьетнам) (Рисунок 1).

Рисунок 1 — Размещение чехлов с образцами полимеровМорская научно-исследовательская и испытательная станция (МНИИС)" Дам Бай" расположена на острове Че в заливе Дам Бай (12є 14' с. ш., 109є 11' в. д.). Удалённость от моря? 50 м. Является береговой и надводной станцией и занимает по площади 2 га на суше и 1,7 га морской акватории.

Таблица 1 — Гидропараметры пресной воды в бассейне с биополимерами

Образцы экспонировали в воде в течение 1 года (январь 2011 — февраль 2012 г.) Для выявления микроорганизмов-деструкторов ПГА высевали соскоб с поверхности полимеров на специализированную питательную среду. Посев производили в трехкратной повторности с использованием разведений 10 — 10⁵. Чашки с посевами выдерживали при температуре 28−30°С, анализ посевов проводили на 5−7 сутки культивирования.

2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве

Материалом для исследования являлась почва, взятая из прикорневой зоны лиственницы (Larix sibirica L.), в которую размещали полимерные пленки из гомополимера (П3ГБ) и сополимера поли-3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (П3ГБ/3ГГ.). Объектом исследований служила микрофлора, выделенная из этой почвы. Эксперимент проводился на территории дендрария Института леса СО РАН им В. Н. Сукачева.

Для изучения процессов биодеструкции ПГА в почве, образцы полимеров в виде пленочных дисков массой 60±6.5 мг (диаметр 30 мм, толщина 80±7 мкм) в нейлоновых сетчатых контейнерах, размещали в почве на глубине 5 см в прикорневой зоне лиственницы (Larix sibirica L.) (рисунок 2).

Рисунок 2 — Полимерные образцы 3ГГ и 3ГБ заложенные в почву

Эксперимент проведен в течение полевого сезона 2012 года в период с 23 мая по 4 ноября. Выявление микроорганизмов-деструкторов ПГА проводили в четыре этапа через 1 месяц экспонирования. Для этого из биопленки, сформированной на поверхности полимера, методом соскоба были взяты микробиологические пробы, которые высевали на специализированную питательную среду. В работе использовали разведения 10⁵ — 10⁸. Чашки с посевами выдерживали при температуре 30 °C. Эксперименты проводили в 3-х кратной повторности.

2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария

Биодеградацию ПГА исследовали в реальных природных условиях, в почве дендрария Института леса СО РАН. Сотрудниками Института леса СО РАН исследованы основные характеристики почвы дендрария и показано, что эта почва характерна для дерново-карбонатного типа. Этот тип почвы сформирован на известняках и других карбонатных почвообразующих породах под хвойными, лиственно-хвойными и широколиственными лесами. Профиль почвы состоит из гумусового горизонта мощностью от 10−15 до 30−40 см и подстилающей его карбонатной породы, окрашен в тёмно-серый цвет. Характерные свойства почвы дендрария — слабощелочная или близкая к нейтральной реакция гумусового горизонта (7,08±0,08), невысокое содержанием гумуса — (2,55±0,13%), полная насыщенность поглощающего комплекса основаниями (Са и Mg), отсутствие дифференциации профиля по механическому составу, водопрочная зернистая и ореховато-зернистая структура, высокая биологическая и микробиологическая активность, значительные запасы питательных веществ (фосфора, калия и азота). Органическое вещество хорошо минерализовано (С: N < 20). В составе поглощающего комплекса преобладает кальций — 20,1±0,5 м-экв/100 г. Перечисленные свойства почвы наиболее устойчивы, вариабильность их по площади участка не значительна: 3,6% по рН, 8,7% - Ca, 15,6% - гумус. Сильно варьирует карбонатность верхнего 40-сантиметрового слоя — коэффициент вариации составляет 52%. Мобильным является и содержание подвижных элементов питания: фосфора и азота. Для почвы питомника характерно повышенное содержание фосфора (58±4,93 мг на кг почвы) и калия (319±8,07 мг на кг почвы) при низкой обеспеченности азотом. Определение нитратного и аммиачного азота в сухих образцах показало, что при невысоком их содержании заметно преобладают аммиачные формы. Количество N-NH₄ одинаково в слоях 0−20 и 20−40 см, тогда как более высокое содержание нитратов приурочено к более гумусированному верхнему слою почвы.

2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны лиственницы

Для проведения анализа взяли почву из прикорневой зоны лиственницы, просушили ее, затем взвесили 10 г.

Поместили почву в колбу емкостью 100 мл, налили 40 мл дистиллированной воды и хорошо перемешали, после чего раствор профильтровали.

Отстоявшуюся жидкость осторожно слили в небольшую колбочку и измерили рН данного раствора. рH = 7.5, 7.3.

2.3 Определение способности бактерий к биодеградации

Определение биодеструктивной способности микромицетов изучали на среде следующего состава (г/л):

ПГБ — 5,0; NaNO₃ — 2,0; KH₂PO₄ — 1,0; KCl, MgSO₄Ч7H₂O — 0,5; FeSO₄Ч7H₂O — 0,01; Пептон — 0,1; Дрожжевой экстракт «Difco» — 0,1; Агар — 20,0. Среда содержала в качестве источника углерода 0,25% порошкообразного полимера (ПГБ).

Рост микроорганизмов, обладающих ПГА-деполимеразной активностью, сопровождался образованием вокруг колоний на поверхности агаризованной среды характерных прозрачных зон (Рисунок 3).

Рисунок 3 — Рост бактерий на среде с ПГА; 1 — деполимеразная активность

2.4 Методы идентификации микроорганизмов

Изучение фенотипических признаков микроорганизмов-деструкторов проводили стандартными микробиологическими методами [12,14]. При идентификации бактериальных изолятов проводили сравнительный анализ их морфологических, культуральных, биохимических свойств. Определяли морфологию вегетативных клеток, спорообразование, подвижность, окраску по Граму, каталазную, оксидазную, амилазную, липазную, лецитиназную, левансахаразную и протеиназную активность, образование кислоты из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы и маннита, восстановление нитратов и потребность в факторах роста.

Принадлежность изучаемых культур к группе грамположительных или грамотрицательных бактерий определяли экспресс-методом Грезерсона. Клетки культур помещали бактериологической петлей в каплю 3% -го раствора КОН на предметное стекло, размешивали круговыми движениями и через 5−6 секунд петлю резко поднимали. Суспензия грамотрицательных бактерий становилась вязкой и тянулась за петлей, образуя тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределялись в капле щелочи. Реакцию считали отрицательной, если образование слизистых тяжей не наблюдалось в течение 60 секунд.

При изучении физико-химических свойств культур, определяли их способность продуцировать каталазу. С помощью бактериологической петли клетки культур перенесли на предметное стекло. Поместили одну каплю 3% раствора пероксида водорода на материал на предметном стекле. Положительная реакция проявлялась быстрым появлением пузырьков газа. При отрицательной реакции в течение 20 секунд выделение газа не происходило.

Для выявления амилолитической активности использовали среду следующего состава (г/л): пептон — 10.0; КН₂РО_{4 -} 5.0; растворимый крахмал — 2.0; агар — 15.0; рН среды 6,8 — 7.0. Среду стерилизовали при температуре 121 єС 30 минут и разлили в стерильные чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 7 суток, при температуре 30єС. Гидролиз крахмала обнаруживали после обработки агаровой поверхности раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливали 3−5 мл раствора Люголя, после чего среда окрашивалась в синий цвет, а зоны гидролиза крахмала приобретали красно-бурую окраску (Рисунок 4).

Рисунок 4 — Тест на амилазную активность

Так же изучали протеолитическую активность у микроорганизмов. Для этого культуры высевали на мясопептонную желатину (МПЖ). К 100 мл мясопептонного бульона (МПБ) добавили 15 г желатины, оставили на 15 минут, чтобы она набухла, затем нагрели на водяной бане до полного растворения желатины и разлили в пробирки по 10 мл. Стерилизовали при температуре 121 єС 15 минут. Посев проводили уколом. Продолжительность культивирования составило 10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины отмечали визуально.

Для выявления липазной и лецитиназной активности использовали желточно-солевую среду следующего состава: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 60−70 єС стерильного МПА (pH 7,2), содержащего 10 г NaCl, добавляли 10−20 мл желточной взвеси, перемешивали и разливали в чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 3 суток, при температуре 27 єС. Визуально отмечали при лецитиназной активности помутнение снизу колоний, а при липазной активности блестящий налет сверху колоний.

Оксидазную активность выделенных изолятов бактерий определяли с помощью тест-полосок окситест (MIKRO-LA-TEST) (Рисунок 5).

Рисунок 5 — Оксидазная активность: а — отрицательная; б — положительная.

Способность исследуемых культур ферментировать углеводы изучали на универсальных средах Гисса. В состав этих сред входят: панкреатический гидролизат кильки, индикатор и различные углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, манит). Среду готовили следующим образом — 15 грамм препарата размешивали в 1 литре дистиллированной воды, кипятили до полного растворения. Разлили в стерильные пробирки. Засев проводили уколом, культивировали в течение 3 дней. Визуально отмечали образование газа и кислоты (Рисунок 6).

Рисунок 6 — Рост бактерий на средах Гисса

Потребность в факторах роста бактерий изучали на среде Фратера (г/л): (NH₄) ₂SO₄ — 1.0; MgSO₄?7H₂O — 0.25; водопроводная вода, K₂HPO₄ — 0.1; глюкоза — 10.0; pH= 6.0−7.0. Среду разлить в пробирки по 5мл. Охарактеризовать рост: слабый, умеренный, обильный. Охарактеризовать пленку на поверхности пробирки, встряхнуть и через неделю опять посмотреть пленку, так как после посева с богатой среды идет адаптация к новым условиям.

Для образования левансахаразы изучается на среде с сахарозой и мелом. В состав среды входят дрожжевая вода, сахароза — 5%, агар — 2%, CaCO₃ — 1%, pH = 6.8−7.0. Стерилизовать при 0.5 атм. Посев осуществляется штрихом на чашки Петри. Образующийся леван представляет собой сиропрастекающуюся массу.

Для восстановление нитратов используют среду Абдельмалека (%): МПБ, глюкоза — 1.0, агар — 0.3, KNO_{3 -} 1.0, pH = 7.0. Растворить МПБ, глюкозу и KNO_3, довести pH до 7.0 и внести агар. Все это расплавить и разлить в пробирки по 10−12 мл. Засев проводят уколом, после чего заливают голодным агаром. Посев описывают через 5−6 дней или даже позже. Отмечают наличие роста по уколу и наличие полостей между средой и столбиком голодного агара.

Глава 3. Результаты исследования

3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы

Микробиологический анализ показал, что в контрольной почве количество бактерий на момент отбора образцов в июне и ноябре было значительно выше, чем в июле и октябре, что объясняется погодными условиями — лето было аномально жарким и сухим. Однако на поверхности полимерных пленок общая численность гетеротрофных бактерий варьировала незначительно (рисунок 7, приложение В).

Рисунок 7 — Общее количество почвенных бактерий (РПА)

По данным литературы полимер является субстратом для микроорганизмов, на нем формируются пленки обрастания, что приводит к увеличению численности микроорганизмов в пленках по сравнению с нативной почвой. В наших исследованиях количество почвенных гетеротрофных бактерий в контрольной почве было выше, чем на поверхности образцов полимеров, или достоверно не отличалась. Однако, количество бактерий-деструкторов, растущих на питательной среде с полимером, к концу эксперимента (ноябрь) было достоверно выше, чем в контрольной почве (рисунок 8).

Рисунок 8 — Общее количество бактерий-деструкторов начальной и конечной точке экспозиции (среда с полимером)

В июне в образцах контрольной почвы и на поверхности полимеров количество бактерий-деструкторов составляло от 1,05 до 4,5Ч10⁸ КОЕ в 1 г, тогда как в ноябре популяция деструкторов увеличилась на поверхности пленок в 5−20 раз по сравнению с исходной. Это связано с тем, что требуется время для индукции синтеза ферментов, гидролизующих ПГА, и развития микроорганизмов-деструкторов.

Из анализируемых групп микроорганизмов были выделены доминирующие бактерии, способные к гидролизу полимера. В результате скрининга было проверено более 33 изолятов бактерий из прикорневой зоны лиственницы и 13 изолятов актиномицетов. Из них 13 изолятов бактерий и 3 изолята актиномицетов, обладали гидролитической активностью по отношению к полимеру (образование прозрачных зон). Видовое разнообразие существенно различалось: количество штаммов-деструкторов в почве с полимером значительно превышало количество штаммов-деструкторов в контрольной почве.

В целом, по совокупности культуральных, морфологических и физиолого-биохимических признаков бактерии-биодеструкторы были отнесены к следующим родам: Nocardioides, Bacillus, Micrococcus, Acinetobacter, Rhizobium, Pseudomonas.

Изучение таксономического состава микрофлоры контрольных образцов почвы показало, что среди бактерий-деструкторов преобладали грамположительные спорообразующие бактерии рода Bacillus, составляющие около 60% идентифицированных видов. Кроме того, были выделены грамотрицательные бактерии Acinetobacter (20%) и Rhizobium (20%) (рисунок 9).

Рисунок 9 — Процентное соотношение бактерий-деструкторов в контрольной почве

В составе микробоценоза, сформировавшегося вокруг полимерных пленок в условиях прикорневой зоны лиственницы, также преобладали представители рода Bacillus (54,5%), на втором месте по численности — Nocardioides (27,3%). В небольшом количестве были представлены следующие бактерии: Micrococcus, Pseudomonas (9.1%) (рисунок 10).

Рисунок 10 — Процентное соотношение бактерий-деструкторов вокруг полимерных пленок

Род Nocardioides. Представители рода образуют плеоморфные элементы и разветвленный вегетативный мицелий. Вегетативный мицелий представлен обильно ветвящимися гифами, растущими на поверхности и проникающими внутрь агаризованной среды; гифы распадаются на фрагменты, которые могут быть неправильной, палочковидной или кокковидной формы.

Воздушный мицелий, если образуется, состоит из неправильных, редко и неправильно ветвящихся или неразветвленных гиф, которые распадаются на палочковидные фрагменты, от коротких до удлиненных. Фрагменты как первичного, так и воздушного мицелия дают новый мицелий.

Встречаются штаммы с подвижными и штаммы с неподвижными клетками. Обнаружены по всему земному шару в почвах, а также в травяном покрове (рисунок 11).

Рисунок 11 — Морфология бактерий рода Nocardioides

Род Bacillus. Этот род представлен грамположительными прямыми палочками, 0,5−2,5Ч1,2−10 мкм, с закругленными концами, часто в парах или цепочках. Подвижные за счет перитрихальных жгутиков. Эндоспоры овальные, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным воздействиям и образуется не боле одной споры в клетке. Аэробы и факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Обычно каталазоположительные. Обнаружены в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных (рисунок 12).

Рисунок 12 — Морфология бактерий рода Bacillus

Род Micrococcus. Представители рода грамположительные клетки сферической формы 0,5−2 мкм, в парах или тетрадах, но не в цепочках. Редко подвижные, неспорообразующие. Облигатные аэробы, хемоорганотрофы. Колонии обычно желтые или красные, растут на простых средах. Каталазоположительные и мало оксидазоположительные. Встречаются на коже млекопитающих и в почве, однако выделены в основном из пещевых продуктов и из воздуха (рисунок 13).

Рисунок 13 — Морфология бактерий рода Micrococcus

Род Acinetobacter. Бактерии рода грамотрицательные палочки диаметром 0,9−1,6 мкм и длинной 1,5−2,5 мкм в стационарной фазе роста становятся сферическими. Обычно в парах и цепочках, спор не образуют. Движение рывками, предположительно обусловленное наличием полярных фимбрий. Аэробы. Оксидазоотрицательные и каталазоположительные. Встречаются в почве, воде и сточных водах (рисунок 14).

Рисунок 14 — Морфология бактерий рода Acinetobacter

Род Rhizobium. Род представлен грамотрицательными палочками, 0,5−0,9Ч1,2−3,0 мкм. Для неблагоприятных для роста условиях обычно плеоморфные, содержащие гранулы поли-в-гидроксибутирата. Подвижные за счет единственного полярного или субполярного жгутика либо перитрихальных жгутиков. Аэробы и хемоорганотрофы. Колонии округлые, выпуклые, полупрозрачные, приподнятые, слизистые. Характерная особенность этих организмов — способность проникать в корневые волоски бобовых тропического пояса и вызывать образование корневых клубеньков, в которых бактерии присутствуют как симбионты (рисунок 15).

Рисунок 15 — Морфология бактерий рода Rhizobium

Род Pseudomonas. Представлен грамотрицательными прямыми или слегка изогнутыми палочками, 0,5−1,0Ч1,5−5,0 мкм. У многих видов накапливается в качестве запасного источника углерода поли-в-гидроксибутират, который виден как включения после окраски суданом. Подвижны за счет одного или нескольких полярных жгутиков; в отдельных случаях неподвижны. Аэробы, хемоорганотрофы. Большинство видов в органических факторах роста не нуждается. Оксидазоположительные или — отрицательные и каталазоположительные. Широко распространены в природе. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений (рисунок 16).

Рисунок 16 — Морфология бактерий рода Pseudomonas

Как показали комплексные исследования, проводимые сотрудниками Института биофизики СО РАН, разрушение полимеров обоих типов в почве под лиственницей в 2013 г. происходило очень медленно из-за недостатка влаги в почве (Приложение Б).

3.2 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксивалерата в пресной воде

Из анализируемых групп микроорганизмов были выделены доминирующие бактерии, способные к гидролизу полимера. Из пленочных образцов было выделено в чистые культуры 15 изолятов бактерий и актиномицетов, обладающих гидролитической активностью в отношении полимера. На основании сходных морфотипов были отобраны 14 штаммов, способных к биодеструкции ПГА, из них 7 штаммов бактерий и 7 штаммов актиномицетов, которые в последующем были идентифицированы по совокупности морфологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических признаков (Приложение А).

Изучение микробиоценоза образцов пресной воды показало, что среди микроорганизмов-деструкторов преобладали грамположительные бактерии: спорообразующие бактерии рода Bacillus, составляющие около 28,6% идентифицированных видов, а также были выделены актиномицеты из родов Streptomyces (28,6%) и Actinomyces (21,4%). Кроме того, были выделены грамотрицательные бактерии Pseudomonas sp (7,14%), Alcaligenes sp (7,14%) и Comamonas sp (7,14%) (рисунок 17).

Рисунок 17 — Процентное соотношение бактерий-деструкторов

Культуры штаммов БП/2, Б-17, Б-17 (б) и Б-19 на агаризованной среде формировали гладкие матовые колонии. Отличались способностью к образованию эндоспор. В нативных препаратах были представлены прямые палочки, подвижные. Грамположительные. Бактерии штаммов БП/2, Б-17, Б-17 (б) и Б-19 проявляли сходство и по другим признакам: каталазо — и оксидазоположительные, активно продуцировали протеазу. Амилазу не продуцируют. Проявляют липазную и лецитиназную активность. Глюкозу, мальтозу и сахарозу ферментировали с образованием кислоты. По совокупности признаков штаммы БП/2, Б-17, Б-17 (б) и Б-19 были отнесены к роду Bacillus (рисунок 18).

Рисунок 18 — Морфология бактерий рода Bacillus

Бактерии штамма БП/6 в нативных препаратах представляли собой прямые палочки. Подвижные, грамотрицательные. Неспорообразующие. Каталазоположительные и оксидазоположительные. Обладали амилолитической и протеолитической активностью. Липазную и лецитиназную активность не проявляют. Аэробные микроорганизмы. Ферментировали с образованием кислоты глюкозу и сахарозу. По совокупности признаков бактерии штамма БП/6 были отнесены к роду Pseudomonas sp. (рисунок 19).

Рисунок 19 — Морфология бактерий рода Pseudomonas sp.

На агаризованной среде бактерии штамма ГВ-10б формировали белые, блестящие колонии. Грамотрицательные кокки. Не образуют спор, не подвижны. Каталазоположительные и оксидазоположительные. Обладали амилолитической и липазной активностью. Протеазу и лецитиназу не продуцируют. Аэробы. Кислоту на средах Гисса не образовывают. По совокупности признаков бактерии штамма ГВ-10б были отнесены к роду Alcaligenes sp. (рисунок 20).

Рисунок 20 — Морфология бактерий рода Alcaligenes sp.

Бактерии штамма Б-18 формировали на РПА белые, блестящие колонии. Клетки в мазках были представлены как грамотрицательные, подвижные, бесспоровые палочки. Каталазоположительные и оксидазоположительные. Обладают амилолитической и протеолитической активностью. Липазной и лецитиназной активность не обладают. Лактозу слабо ферментатировали с образованием кислоты; глюкозу, мальтозу, сахарозу и манит, не усваивали. По совокупности признаков штамм Б-18 был отнесен к роду Comamonas sp. (рисунок 21).

Рисунок 21 — Морфология бактерий рода Comamonas sp.

Культуры штаммов БП/2 (А), БП/1 (А), БП/5 (А) и ГВ-9а формировали субстратный и воздушный мицелий и спирально изогнутые спорангии, образующие цепочки спор. Споры неподвижные. Колонии обособленные и лишайникоподобные, маслянистые. Образуют желтый и белый пигменты. Грамположительные. Аэробы. Каталазоположительные. По совокупности признаков штаммы БП/2 (А), БП/1 (А), БП/5 (А) и ГВ-9а были отнесены к роду Streptomyces (рисунок 22).

Рисунок 22 — Морфология актиномицетов рода Streptomyces.

Заключение

1. Определена общая численность почвенных бактерий в прикорневой зоне лиственницы, а также в почве с поверхности полимерных пленок. Показано, что в опытных образцах количество бактерий-деструкторов полигидроксиалканоатов увеличивалось к концу вегетационного периода в 5−20 раз, тогда как в контроле — лишь в 1,4 раза.

2. Из 16 изолятов почвенных бактерий, обладающих гидролитической активностью в отношении ПГА, идентифицированы представители родов Bacillus, Nocardioides, Micrococcus, Acinetobacter, Rhizobium и Pseudomonas.

3. Из 14 изолятов тропических пресноводных бактерий, обладающих гидролитической активностью в отношении ПГА, идентифицированы представители родов Bacillus, Alcaligenes, Comamonas, Streptomyces и Pseudomonas.

4. Среди микроорганизмов деструкторов преобладали представители рода Bacillus, доля которых составляла от 28,6 до 60% от всех выделенных штаммов.

Список используемых источников

1. Волова Т. Г. Биотехнология. — Изд. 2-е, перераб. — Красноярск, 2002.

2. Волова Т. Г., Севастьянов В. И., Шишацкая Е. И. Полиоксиалканоаты (ПГА) — биоразрушаемые полимеры для медицины. — Новосибирск: СО РАН, 2003. — 330с.

3. Волова Т. Г., Беляева О. Г., Калачева Г. С. Исследование разрушаемости микробных полимеров // Сибирский экологический журнал — 1997, № 5 — С.505−510.

4. Волова Т. Г., Калачева Г. С. Полиоксибутират — термопластичный биодеградируемый полимер (получение, свойства, применение). — Красноярск, 1990. — 47 с.

5. Волова Т. Г., Луковенко С. Г., Васильев А. Д. Получение и исследование физико-химических свойств микробных полиоксиалканоатов // Биотехнология — 1994. — С. 19−22.

6. Волова Т. Г., Бояндин А. Н., Васильев А. Д. [и др.]. Биодеградация поли-гидроксиалконатов (ПГА) в Восточном море и идентификация ПГА-деградирующих бактерий // Микробиология. — 2011. — Т.80,№ 2. — С.266−274.

7. Гоготов И. Н. Биоразлагаемые полимеры: свойства, практическое использование, утилизация // Экология и промышленность России. 2007, октябрь. С.16−19.

8. Звягинцев Д. Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. — М.: изд-во МГУ, 1990.303 с.

9. Мокеева В. Л., Чекунова Л. Н., Мышкина В. Л. [и др.] Биодеструкция поли-в-гидроксибутирата микроскопическими грибами: испытание грибостойкости и фунгицидных свойств полимера // Микология и фитопатология. — 2002. — Т.36, вып.5. — С.59−63.

10. Pandey J.K., Reddy K.R., Kumar A.P., Singh R.P. An overview on the degradability of polymer nanocomposites. // Polymer Degradation and Stability. — 2005. — V.88. — P.234−250.

11. Bahri Z., Taverdet J.L. Elaboration and characterization of microparticles loaded by pesticide model // Powder Technology. — 2006. — Vol.172. — P.31−41.

12. Kasuya K.I. [et al.] Biochemical and molecular characterization of the polyhydroxybutyrate depolyme-rase of Comamonas acidovorans YM1609, isolated from freshwater //. Appl. Environ. Microbiol. — 1997. — Vol.63, No.12. — P.4844−4852.

13. Bonartsev A.P., Zaikov G.E., Krylova L. P [et al.]. Biodegradation and medical application of microbial poly (3-hydroxybutyrate) // Biotechnology, Biodegradation Water and Foodstuffs. — Nova Science Publishers, Inc., 2009. — P.1−35.

14. Braunegg, G., Lefebvre G., Genzer K. F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (Rewiew article). — of Biotechnol, 1998. — N 65. — P.127−161.

15. Brandl, H.J., Knee E. Ability of phototrophic bacterium Rhodospirillum rubrum to produce various poly (B-hydroxyalkanoates) potencial sources for biodegradable polyesters. — Int. J. Biol. Macromol. — Vol 11. — Feb. — 1989. — P.49−56.

16. Brucato C., Wong S. Extracellular poly (3 — hydroxybutyrate) from Penicillum funiculosum: general charac-teristics and active // Arch. Biochem. Byophys. — 1991. — Vol.290. — P.497−502.

17. Chen G. — Q., Wua Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials // Biomaterials. — 2005.

18. Chen G.Q., Steinbuche Chen A. Plastics Completely Synthesized by Bacteria: Polyhydroxyalkanoates in Plastics from Bacteria-Natural Functions and Applications // New York. — 2010. — P.17−37.

19. Cheng M. — L. Change of structure and free volume properties of semi-crystalline poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) during thermal treatments by positron annihilation lifetime // Polymer. — 2009.

20. Damalas C.A., Eleftherohorinos I.G., Environ J. Pesticide Exposure, Safety Issues, and Risk Assessment Indicators // Int. Res. Public Health. — 2011. — Vol.8. — P.1402−1419.

21. Dawes, E.A. Novel biodegradable microbial polymers. Kluwer Academic, Dordrecht. — Netherlands, P. 1990. — 287.

22. Delafield, F.P., Doudoroff M., Palleroni N.J. Decomposition of poly-B-Hydroxybutyrate by Pseudomonas. — J. of Bacteriology, Vol.90, 1965 (5). — P.1455−1466.

23. Jendrossek D., Schimer A., Schlegel H. Biodegradation of polyhydroxyalkanoik acid. — Appl Microbiol Biotechnol, 1990. — p.451 — 463.

24. Do Young Kim, Hyung Woo Kim, Moon Gyu Chung, Young Ha Rhee. Biosynthesis, modification and biodegradation of bacterial medium-chain-length polyhydroxyalkanoates // The Journal of Microbiology. — 2007. — Vol.4, No.2. — P.87−97.

25. Fuller Clinton, R. Microbial inclusions with special reference to PHA inclusions and intracellular boundary envelpes // In. J. Biological Macromol. — 1999. — Vol.25. — P.21−29.