Получение внеклеточных полисахаридов

• Введение
• 1. Многообразие внеклеточных полисахаридов и их сферы их использования
• Пектиновые вещества растений
• Растительные камеди и слизи
• Хитин
• Мукополисахариды животной соединительной ткани
• Углеводсодержащие биополимеры, обеспечивающие межклеточные коммуникации
• 2. Общая методология выделения и очистки полисахаридов
• Список использованной литературы
• Приложения

Наряду с белками и нуклеиновыми кислотами, полисахариды — широко распространённый класс биополимеров, представители которого обнаруживаются в тканях всех живых организмов и вовлекаются в течение важнейших биологических процессов.

Ряд полисахаридов секретируется во внешнюю среду; этот процесс характерен как для одноклеточных, так и для многоклеточных организмов, причём у последних он часто обеспечивается наличием высокоспециализированных клеток-продуцентов в тканях. Такие секретируемые полисахариды называются внеклеточными.

Представителями внеклеточных полисахаридов, а также углеводсодержащих внеклеточных полимеров являются пектиновые вещества, камеди и слизи растений, мукополисахариды животной соединительной ткани, гликопротеины плазмы, хитиновые вещества наружного скелета членистоногих животных, полисахариды бактериальных капсул и др. см. табл.1

Внеклеточные полисахариды широко применяются в медицине и различных отраслях промышленности, поэтому их получение является одной из важных задач биотехнологии.

Таблица 1 [4]

внеклеточный полисахарид выделение очистка

1. Многообразие внеклеточных полисахаридов и их сферы их использования

Пектиновые вещества растений

Важный компонент растительных тканей — пектиновые вещества. Мономером любого пектинового вещества является остаток D-галактуроновой кислоты, карбоксильная группа которого может быть этерифицирована метанолом. Кроме того, пектиновые вещества содержат сравнительно небольшое количество остатков других D — (галактоза, ксилоза) и L-сахаров (арабиноза, рамноза, фукоза). Мономеры, соединённые б-1,4-гликозидными связями, образуют разветвлённые цепи. [4]

Пектиновые вещества классифицируют в зависимости от строения мономеров и степени полимеризации. Различают:

1. пектовые кислоты (простейшие представители пектиновых веществ, содержащие до 100 мономеров, c немодифицированными карбоксильными группами);

2. пектаты (соли пектовых кислот);

3. пектиновые кислоты (пектины) (более высокомолекулярные соединения, содержащие 100−200 мономеров, часть карбоксильных групп этерифицирована метанолом);

4. пектинаты (соли пектиновых кислот);

5. протопектины (нерастворимые в воде высокомолекулярные полимеры, в которых метоксилированная полигалактуроновая кислота связана с полисахаридами клеточной стенки). [6]

Особенно богаты пектиновыми веществами ткани, состоящие из клеток, лишённых вторичной клеточной стенки (например, мякоть плодов). Нерастворимые пектиновые вещества (пропектин) образуют межклеточное вещество молодых растительных тканей, а также присутствуют в скоплениях клеток некоторых водорослей. [4]

В производстве пищевых продуктов, например, фруктовых и желейных консервов, варенья, джема, конфитюра или пектин применяют в качестве гелеобразователя. Желирование высокоэтерифицированных пектинов — это процесс, при котором полимерные молекулы в условиях высокой кислотности и высокого содержания сухих веществ взаимодействуют друг с другом через образование водородных мостиков, формируя плотную пространственную структуру, называемую гелем или желе. Молекулы пектина образуют равномерно распределенную трехмерную сеть, связывая при этом большое количество воды. Желирование низкоэтерифицированных пектинов происходит как по механизму желирования высокоэтерифицированных пектинов, так и в результате взаимодействия с ионами поливалентных металлов, например, с ионами кальция. При этом ионы кальция являются связующими звеньями между полимерными молекулами пектина, образующими пространственную структуру геля (желе).

Именно гелеобразующая способность пектина является определяющим фактором его широкого применения в пищевой промышленности. Комплексообразующая способность основана на взаимодействии молекулы пектина с ионами тяжелых и радиоактивных металлов. Благодаря наличию в молекулах большого количества свободных карбоксильных групп именно низкоэтерифицированные пектины проявляют наибольшую эффективность. Специальные препараты, содержащие комплексы высок — и низкоэтерифицированных пектинов, включают в рацион питания лиц, находящихся в среде, загрязненной радионуклидами, и имеющих контакт с тяжелыми металлами. Специальные высокоочищенные пектины могут быть отнесены к незаменимому веществу для использования в производстве функциональных пищевых продуктов, а также продуктов профилактического и лечебного питания. [6]

Растительные камеди и слизи

Камеди — это полисахариды, выделяющиеся в виде вязких растворов и образующие стеклообразную массу при повреждении коры многих растений. Способность образовывать камеди распространена в растительном мире очень широко. Наиболее известные камеденосные растения относятся к бобовым и розоцветным.

Образование камедей в растении обычно связывают с патологическим состоянием — повреждениями механическими или инфекционными (например, бактериальные или грибковые заболевания) и просто с неблагоприятными условиями существования. Слизи, напротив, являются продуктами нормального метаболизма растения и служат либо пищевым резервом, либо веществами, удерживающими воду, особенно в тканях суккулентов.

В настоящее время камеди и слизи нельзя разграничить по химическому строению, но достоверно известно, что среди слизей гораздо больше полисахаридов с относительно простой структурой. [4]

В состав камедей входят гексозы (галактоза и манноза), пентозы (арабиноза и ксилоза), метилпентозы (рамноза и фукоза), уроновые кислоты (глюкуроновая и галактуроновая). Уроновые кислоты образуют соли с ионами К⁺, Ca²⁺, Mg²⁺. [6]

Слизи отличаются значительным преобладанием пентоз. В отличие от камедей они могут быть нейтральными, т. е. не содержать уроновых кислот. Различают слизи нейтральные (слизь салепа) и кислые (слизь алтея, льна, подорожника блошного). Кислая реакция обусловлена наличием в составе слизей уроновых кислот.

В медицинской практике камеди используются для приготовления эмульсий, таблеток и пилюль. Камеди также находят применение в пищевой, текстильной, кожевенной, лакокрасочной промышленности.

Слизи используют как противовоспалительные и обволакивающие средства. Кроме того, слизи обладают радиопротекторными и иммунозащитными свойствами. [6]

Хитин

Основным компонентом наружного скелета (кутикулы) членистоногих и других беспозвоночных является хитин, замещающий также частично или полностью целлюлозу в клеточных стенках сапрофитных растений, например грибов. Данный полисахарид является однородным линейным полимером N-ацетилглюклзамина. По строению и физико-химическим свойствам хитин близок к целлюлозе. [4]

Как и целлюлоза, хитин и его производные обладают волокно — и плёнкообразующими свойствами. Благодаря биосовместимости с тканями человека, низкой токсичности, способности усиливать регенеративные процессы при заживлении ран, биодеградируемости такие материалы представляют особый интерес для медицины. Так, при лечении гнойных и ожоговых ран широко применяются ферменты, эффективность использования которых может быть повышена за счет их включения в структуру волокон и губок.; связь между полимером-носителем и ферментом создаёт предпосылки для регулирования активности и стабильности фермента, скорости его диффузии в рану.

С использованием хитина создаются биодеградируемые носители фармацевтических препаратов (антибиотиков, антивирусных, противоопухолевых и антиаллергенных препаратов) в виде плёнок (мембран). Применение таких плёнок создает условия для выделения лекарственных средств, обеспечивая пролонгирование их действия.

Полимерные комплексообразователи, в т. ч. и хитин, могут рассматриваться как реальная альтернатива традиционным методам очистки сточных вод промышленных предприятий от соединений металлов, используемых для нанесения защитных покрытий (никель, хром, цинк), а также от таких металлов, как ртуть и кадмий, способных аккумулироваться живыми организмами. Наличие электронодонорных амино — и гидроксильных групп, широкие возможности введения различных ионогенных групп кислотного и основного характера делают производные хитина перспективными для использования в хроматографии при разделении и очистке биологически активных соединений (нуклеиновых кислот и продуктов их гидролиза, стероидов, аминокислот). [1]

Мукополисахариды животной соединительной ткани

Межклеточное вещество животных соединительных тканей представлено кислыми мукополисахаридами, в числе которых гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дермантан — и кератансульфаты. Эти полисахариды построены из чередующихся остатков аминосахаров и уроновых кислот; в некоторых мукополисахаридах присутствуют также остатки серной кислоты. В ходе гистогенеза они синтезируются во внешнюю среду специализированными клетками, и только после накопления определённого уровня этих веществ в ткани появляются белковые волокна (коллаген, эластин) и минеральные структуры (фосфат кальция в костной ткани и т. п.). [5]

Гиалуроновая кислота и хондронтинсульфаты А, В и С представляют собой семейство родственных полисахаридов, отличающихся только конфигурацией остатка амнносахарида при С₄, конфигурацией остатка уроновой кислоты при С₆ и положением сульфатных групп.

Вышеперечисленные вещества применяются в основном в качестве противовоспалительных средств.

К полисахаридам соединительной ткани также принадлежит гепарин — антикоагулянт крови; он находится во многих тканях организма, но в наибольшем количестве содержится в печени (отсюда его название), лёгких и мышцах. В состав гепарина входят D-глюкозамин и D-глюкуроновая кислота и около пяти остатков серной кислоты на каждый тетрасахаридный фрагмент. В медицине он применяется для лечения и профилактики тромбозов. [3]

Углеводсодержащие биополимеры, обеспечивающие межклеточные коммуникации

Внеклеточные углеводсодержащие биополимеры могут в значительной степени обеспечивать сцеплении клеток. Так, клетки, образующиеся при делении яйца морского ежа, удерживаютсяв соединении друг с другом лишь в том случае, если присутствует внеклеточный полисахарид гиалин. Такого рода внеклеточные углеводсодержащие биополимеры играют, вероятно, важную роль в процессах тканевой дифференциации.

Характерные свойства злокачественных опухолей — многослойный хаотический рост, способность врастать в нормальные ткани, способность к метастазированию — связаны, помимо прочих факторов, с уменьшением сил сцепления между клетками опухолей. Эти явления, по-видимому, связаны с выработкой клетками опухолей значительных количеств мукополисахаридов, откладывающихся на поверхности клеток. [4]

Внеклеточные полисахариды микроорганизмов

Полисахариды этой группы накапливаются обычно в значительных количествах в культуральных жидкостях микроорганизмов и, как правило, достаточно легко могут быть выделены.

Имеющиеся данные о структуре этих полисахаридов указывают на чрезвычайно большое разнообразие их моносахарндного состава и типов связей. Многие микроорганизмы вырабатывают внеклеточные полисахариды, идентичные или близкие полисахаридам, выделенным из тканей животных и растений. Так, бактерии рода Acetobacter синтезируют целлюлозу, а стрептококки группы, А и С — гиалуроновую кислоту. В состав слизистого слоя многих бактерий родов Pseudomonas и Bacillus входят леваны — фруктаны с главным типом связи в-2,6, близкие к флеанам растений.

С другой стороны, внеклеточные полисахариды многих микроорганизмов совершенно уникальны по своей структуре и специфичны для данного вида микроорганизма или, чаще, для серологической группы данного вида.

В глюканах, выделенных из животных или растений, преобладают обычно б-1,4, в-1,4 — или в — 1,3-связи между остатками глюкопиранозы; в глюканах микроорганизмов часто встречаются и иные типы связей. Так, полисахарид короннго галла Agrobacterium tumefacienc содержит в-1,2-связи,; нигеран, выделенный из культуральной жидкости Aspergillus niger — б-1,3 (помимо «традиционных» б-1,4); лютеоза, продуцируемая плесневым грибом Penicillium luteum при выращивании последнего на искусственных средах, является в-1,6 — глюканом.

Декстраны — обширная группа глюканов, вырабатываемых некоторыми бактериями родов Leuconostoc и Streptococcus при культивировании на растворах, содержащих сахарозу. Декстраны образуют растворы высокой вязкости; общая черта их структуры — преобладание б-1,6-гликозидных связей. [4]

В настоящее время декстраны производятся в значительных количествах в промышленном масштабе. Это связано с большим значением частично деполимеризованных кислотным гидролизом декстранов как заменителей плазмы крови. Они менее токсичны и более соответствуют по своим осмотическим свойствам и вязкости свойствам крови, чем все другие изученные заменители плазмы. Сульфаты декстрана подавляют свёртывание крови и могут служить заменителем гепарина при переливании крови.

Декстраны служат исходными веществами при получении молекулярных сит — сефадексов, нашедших сейчас широкое применение в лабораторной практике. Описаны также многие другие технические применения декстранов. [2, 4]

2. Общая методология выделения и очистки полисахаридов

При выделении индивидуальных полисахаридов приходится решать три задачи разной степени сложности (следует отметить, что они редко являются последовательными этапами выделения):

1) отделение низкомолекулярных веществ;

2) отделение биополимеров неуглеводной природы

3) разделение смесей полисахаридов. При выборе метода для решения очередной задачи следует учитывать те свойства целевого биополимера, по которым он отличается от других компонентов исходной смеси; эти различия и должны выявляться посредством применения искомого метода. Описан ряд параметров, на основании которых возможно произвести разделение веществ: молекулярный вес, растворимость, температуры плавления и кипения, способность вступать в качественные реакции с определёнными соединениями и т. п.; большинство из них зависит от химической структуры веществ. [3]

Полисахариды представляют собой линейные или разветвлённые цепи, состоящие из моносахаридных остатков, соединённых гликозидными связями. В природных полисахаридах обычно встречаются остатки гексоз (глюкоза, галактоза, манноза), пентоз (арабиноза, ксилоза), 6 — дезоксигексоз (рамноза, фукоза), 2-аминосахаров (глюкозамин, галактозамин), уроновых кислот, а также заместители неуглеводной природы — остатки серной или фосфорной кислот, уксусной кислоты, метанола и др.; смешанные биополимеры могут содержать, помимо угдеводного участка, белковый или липидный компоненты. В зависимости от моносахаридного состава, различают гомополисахариды (продукты поликонденсации мономеров одного типа — например, только остатков глюкозы) и гетерополисахариды (которые, соответственно, включают разные типы моносахаридных остатков). Каждый моносахарид может находиться в пиранозной или фуранозной форме и быть присоединённым к любой из свободных гидроксильных групп соседнего мономера б — или в-гликозидной связью, а также нести один или несколько неуглеводных заместителей (остатки кислот, спиртов и др.) Основной функциональной группировкой полисахаридов является гидроксильная группа, превращения которой (прежде всего, окисление и образование простых и сложных эфиров) оказывают значительное влияние на условия процесса выделения полисахарида. Другие функциональные группы также подвержены различным модификациям: карбоксильные группы уроновых кислот могут быть этерифицированы или восстановлены, аминогруппы аминосахаров — ацилированы, и др. [4]

Полисахариды высокополярны ввиду наличия больщого количества гидроксильных групп. Соответственно, растворимость полисахарида должна быть прямо пропорциональна полярности растворителя. Все полисахариды плохо растворимы в формамиде и диметилсульфоксиде и практически нерастворимы в спиртах, однако растворимость в воде определяется не только полярностью, но и степенью упорядоченности строения макромолекулы. Внеклеточный полисахарид хитин и подобные ему полисахариды с регулярной структурой и линейной конформацией обладают высокой энергией межмолекулярного взаимодействия, превосходящей энергию гидратации; поэтому эти соединения всего лишь слабо набухают в воде. Полисахарид разветвлённого строения (например, разветвлённые пектиновые кислоты) существует в водных растворах в виде беспорядочно свёрнутого рыхлого клубка и, благодаря большим размерам и гибкости макромолекул, связывает огромное количество растворителя (объём такого клубка во много раз превышает изначальный объём макромолекулы). Кроме того, полисахариды склонны к образованию ассоциаций в растворах за счёт межмолекулярных водородных связей; при малых объёмах жидкости это может привести к возникновению нерастворимых форм.

Ввиду многообразия изученных полисахаридов, разработка стандартной процедуры их выделения и очистки не представляется возможной; тем не менее, вне зависимости от природы целевого соединения процесс должен быть максимально эффективным, т. е. обеспечивать максимальный выход продукта; полисахарид не должен подвергаться деструкции под воздействием химических реагентов, использованных для его выделения, либо ферментов, присутствующих в составе сырья.

Экстракция. Метод экстракции подразумевает извлечение веществ, содержащихся в сырье, в раствор, и используется как начальный этап очистки. Возможно два варианта экстракции:

1) растворение полисахарида и ряда сопутствующих веществ и отделение нерастворимых примесей. Таким образом получают растительные слизи и некоторые бактериальные экзополисахариды. Чаще всего в качестве растворителя используют воду, однако полисахариды с большим количеством кислотных функциональных групп лучше растворяются в разбавленных минеральных кислотах, а гемицеллюлозы экстрагируют в щелочной среде.

Экстракция полисахаридов сопровождается растворением полярных низкомолекулярных соединений, некоторых белков и нуклеиновых кислот, поэтому дальнейшая обработка экстракта предусматривает удаление этих веществ.

2) выделение полисахарида из смеси в виде осадка. Так, хитин и целлюлоза сохраняют целостность структуры при жёсткой щелочной или окислительной обработке, которая приводит к деструкции остальных биополимеров.

Экстракция требует предварительного измельчения сырья; при этом часть фибриллярных молекул может быть повреждена либо механическим путём, либо окислением кислородом воздуха (последнее — в щелочной среде).

Необходимость в экстракции отпадает при выделении полисахаридов из жидкостей биологического происхождения, где они изначально находятся в растворе (культуральные жидкости, плазма крови и т. п.).

Осаждение. Перевод вещества из раствора в осадок можно осуществить несколькими путями:

1) нагревание экстракта/исходной смеси с последующим охлаждением. В ходе данной процедуры выпадают в осадок полисахариды, растворимость которых в горячей воде значительно выше, чем в холодной: в-глюкан из овса, инулин и др.

2) осаждение органическим растворителем, смешивающимся с водой. Обычно применяют 80% этанол, который растворяет низкомолекулярные примеси, в т. ч. олигосахариды, в то время как полисахариды выпадают в осадок.

3) фракционное осаждение. В этом случае получают серию фракций осаждаемых веществ, соответствующих разным концентрациям осадителя в растворе; в каждой фракции содержание целевого полисахарида выше, чем в предыдущей. Данный способ может быть пригоден для разделения смеси полисахаридов. Например, кислые полисахариды могут быть отделены от нейтральных в виде нерастворимых кальциевых или бариевых солей.

4) добавление комплексообразователей. Остатки уроновых кислот и моносахаридов с соседними цис-гидроксильными группами образуют нерастворимые комплексы с ионами меди; высокомолекулярные комплексообразователи (галактоманнан, амилоза) взаимодействуют таким же образом с целлюлозой, и т. п. Наиболее избирательным методом такого осаждения является применение антисывороток. [3]

В результате осаждения полисахаридов из первичных экстрактов часто получают смеси, загрязнённые неуглеводными примесями, в первую очередь белком и неорганическими солями, поэтому необходимо подвергнуть экстракт предварительной обработке посредством диализа, ультрафильтрования или ферментативной очистки.

Диализ. В процессе диализа раствор экстракта помещают в целлофан, погружённый в воду; при этом низкомолекулярные примеси диффундируют через целлофан наружу. Диффузия ускоряется под действием электрического поля (электродиализ) или при перемешивании. Для удаления катионов из растворов кислых полисахаридов диализ проводят в подкисленной среде.

Ультрафильтрование представляет собой фильтрование раствора через полупроницаемую мембрану с определённой величиной пор и так же позволяет избавиться от низкомолекулярных примесей.

Ферментативная обработка разрушает высокомолекулярные примеси, которые не удаётся удалить при помощи диализа. Очистка раствора от использованного фермента осуществляется одним из методов денатурации белков: нагревание, действие химических реагентов (щёлочи, трихлоруксусной кислоты, хлороформа с амиловым спиртом и т. д.), избирательная сорбция белков на геле фосфата кальция. Эти же методы применяются для деструкции неферментных белков, загрязняющих раствор. [7]

Хроматография - разделение веществ, различающихся по определённым физико-химическим параметрам.

Вид хроматографии, основанный на разделении веществ по молекулярному весу — гель-фильтрация на сефандексе. Сефандекс — полусинтетический сорбент полисахаридной природы; его гранулы содержат поры и формируют т. н. «молекулярное сито», которое задерживает внутри низкомолекулярные вещества и не препятствует диффузии полимеров. Существуют наборы сефандексов с различной величиной пор для разделения смеси полисахаридов. Таким способом получают декстраны. [7]

Ионообменная хроматография позволяет разделить вещества в соответствии с их зарядом (например, отделить кислые полисахариды от нейтральных). Ионообменник — это твёрдый носитель заряженных групп, которые способны за счёт электростатистического взаимодействия связывать ионы исследуемых молекул. Таким образом, заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником и могут быть элюированы для дальнейшей обработки. [7]

Распределительная и адсорбционная хроматография не нашли широкого применения в области получения полисахаридов. [4]

Распределительная хроматография выявляет разную подвижность исследуемых веществ при распределении последних между двумя фазами, стационарной (матрикс = носитель = сорбент) и мобильной (растворитель = проявитель). Адсорбционная хроматография может разделить вещества в том случае, если при одинаковых концентрациях они демонстрируют разную степень связывания с сорбентом. Трудности, которые возникают при использовании данных видов хромтографии при работе с растворами полисахаридов, обусловлены склонностью последних к межмолекулярной ассоциации и образованию коллоидных растворов.

Электрофорез основан на способности веществ, имеющих заряженные группы атомов, двигаться в растворителе под действием электрического поля. [7]

Использование данного метода ограничено сложностью подбора условий эффективного разделения (состав буферной смеси, концентрация растворителя, сила тока, продолжительность фореза и др.). Тем не менее, электрофорез успешно используется для отделения сульфированных полисахаридов от полиуронидов водорослей, маннаны от глюканов Candida albicans и компоненты других гетерогенных полисахаридных смесей. [4]

Ультрацентрифугирование (седиментация) обеспечивает концентрационное распределение веществ по центрифужной пробирке под действием центробежной силы. Измерение длины траектории движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определением скорости седиментации; зная эту величину, можно вычислить коэффициент седиментации — показатель, значение которого зависит от молекулярной массы и формы частицы. [7]

Процесс выделения полисахаридов из культуральной жидкости микроорганизмов можно облегчить путём изменения поверхностных свойств микроорганизма-продуцента (например, за счёт удаления поверхностного полимерного материала типа липополисахаридов). В подобных мутантных культурах происходит спонтанная аутоагглютинация, что уменьшает число необходимых операций центрифугирования. Однако нужно внимательно следить за тем, чтобы клеточный материал таких мутантов не выходил из периплазматического пространства; необходимо также избегать лизиса клеток с последующим загрязнением конечного продукта. К другим изменениям относятся мутации капсулообразующих организмов, приводящие к появлению стабильных, образующих слизи бактерий, а также получение устойчивых к фагам мутантов, что уменьшает риск заражения фагом в процессе производства.

Реальную опасность при выделении полисахаридов представляет деструкция под действием ферментов. Растворы полисахаридов могут служить средой для роста микроорганизмов, попадающих туда из воздуха лаборатории. Для предотвращения расщепления полисахаридов ферментами микроорганизмов к растворам прибавляют толуол, тимол или хранят их при низкой температуре. [1]

1. Гальбрайх Л. С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соровский образовательный журнал. — 2001. — Т.7, № 1. — с.51−56.

2. Елинов Н. П. Химия микробных полисахаридов // М.: Химия. — 1984. — 256 с.

3. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия: учебник для хим., биол. и мед. спец. вузов // М.: Высшая школа. — 2000. — 479 с.

4. Кочетков Н. К. и др. Химия углеводов. // М.: Химия. — 1967. — 672 с.

5. Краткая химическая энциклопедия в 5 томах под ред. Кнунянц И. Л. т.3: Статьи от «Мальтаза» до «Пиролиз» // М.: Советская энциклопедия. — 1964. — 555 с.

6. Лекарственное сырьё растительного и животного происхождения. Фармакогнозия: учебное пособие под ред. Г. П. Яковлева // Спб.: СпецЛит. — 2006. — 845 с.: ил.

7. Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии. Пер. с англ. // М.: Мир. — 1980. — 581 с.

Приложения

Приложение 1. Особенности выделения и очистки некоторых внеклеточных полисахаридов

(сводная таблица)