Извлечение эмбрионов. 
Трансплантация эмбрионов

Нехирургическое извлечение эмбрионов не требует специального операционного помещения. Его можно с успехом проводить непосредственно на ферме, с соблюдением правил асептики.

Обычно извлечение эмбрионов проводят на 7−8 день после осеменения донора (день охоты принимают за 0 день).

Перед извлечением эмбрионов проводят ректальное исследование донора для определения состояния половой системы и уровня реакции полиовуляции. При этом обращают внимание на величину, консистенцию яичников, подсчитывают количество желтых тел, неовулировавших фолликулов. Точно определить количество желтых тел при средней и хорошей реакции донора методом ректальной пальпации невозможно, поэтому уровень реакции устанавливают приблизительно. Желательно также при исследовании определить качество желтых тел по м.

Подготовка инструментов Для извлечения эмбрионов необходимы следующие инструменты и растворы:

• — катетер для извлечения эмбрионов в сборе;
• — санитарный чехол;
• — два пластиковых шприца на 50−60 см;
• — шприц для воздуха (10−20 см³);
• — два зажима для шлангов;
• — шприц для инъекций на 10 см³ и на 5 см³ с иглами;
• — емкость для сбора вымывной жидкости или фильтр для эмбрионов (ФЭ-1) в сборе с приемником;
• — среда Дюльбекко для извлечения эмбрионов (400−1000 см);
• — среда для санации матки (100 см);
• — 2% раствор новокаина для сакральной анестезии (5 см);
• — фильтровальная бумага или бумажные салфетки;
• — 70° этиловый спирт;
• — одноразовые перчатки.

Вымытые и высушенные катетер и стилет орошают 70° этанолом снаружи и внутри, тщательно ополаскивают средой для извлечения эмбрионов и собирают, для чего стилет вводят в центральный канал катетера и фиксируют его резьбовым замком. Катетер в собранном виде помещают в санитарный чехол и кладут на столик на стерильную салфетку.

Все инструменты и среды, используемые для извлечения эмбрионов, должны быть стерильными.

Извлечение эмбрионов Корову-донора фиксируют в станке. Для снятия моторики кишечника и расслабления матки вводят эпидурально 5 см³ 2% раствора новокаина. Хвост животного отводят в сторону и фиксируют в этом положении, чтобы он не мешал при работе. Прямую кишку очищают от фекальных масс, обмывают водой наружные половые органы, высушивают и тщательно протирают бумажной салфеткой.

Технолог аккуратно вводит катетер во влагалище до упора в шейку матки и под ректальным контролем проводит катетер через шейку матки в тело, продвигает его в правый (или левый) рог до тех пор, пока не почувствует, что конец катетера упирается в изгиб рога. Ассистент освобождает резьбовой зажим стилета, и технолог, вытаскивая стилет, продвигает катетер дальше в рог матки. После того, как катетер введен глубоко в рог матки, ассистент окончательно вынимает стилет и накачивает в манжетку катетера 10−15 см³ воздуха.

Среду для извлечения эмбрионов вводят в рог матки отдельными порциями с помощью пластикового шприца емкостью 50−60 см³. Когда жидкость введена, технолог, легко массируя рог пальцами, всасывает жидкость обратно в шприц. Жидкость из шприца аккуратно сливают по стенке в стерильную емкость или эмбриональный фильтр. На промывание одного рога расходуется 200−500 см³ среды.

После промывания полости одного рога матки технолог вводит стилет в катетер, отодвигает катетер назад в тело матки, переводит его в другой рог и повторяет все манипуляции.

После извлечения последней порции жидкости из второго рога проводят санацию матки. Для этого, не выпуская из манжетки воздух, к катетеру присоединяют шприц с 40 см³ среды, содержащей антибиотики широкого спектра действия или санирующие препараты, используемые в среде для извлечения эмбрионов (ГАМП или полиген из расчета 300- 600 мкг на 1 см³ среды).

При правильно проведенном извлечении потери жидкости, как правило, не превышают 50 см³.

Катетер и стилет после работы тщательно промывают проточной водой с нейтральным моющим средством, ополаскивают дистиллированной водой, обрабатывают 70° спиртом и высушивают.

Поиск эмбрионов Используют два основных способа поиска эмбрионов:

• 1 способ. Вымывную жидкость отстаивают при комнатной температуре не менее 30 минут, чтобы эмбрионы опустились на дно сосуда. Затем верхние слои жидкости аккуратно отсасывают с помощью сифона, оставляя в сосуде 60−100 см жидкости, и, осторожно перемешав, разливают в 2−3чашки Петри. Чашку Петри с жидкостью помешают на предметный столик стереомикроскопа. Поиск эмбрионов упорядочивается при использовании чашки Петри с разлинованным на полоски дном. Расстояние между соседними линиями составляет приблизительно 1 см.
• 2 способ. Вымывную жидкость фильтруют через эмбриональный фильтр ФЭ-1и поиск эмбрионов проводят непосредственно в фильтре.

Фокусировку микроскопа проводят по нижнему слою жидкости или по образовавшемуся осадку на дне чашки, так как именно в этом слое должны находиться извлеченные эмбрионы. Поиск проводят при 10 или 15-кратном увеличении стереомикроскопа, последовательно и тщательно просматривая каждую порцию жидкости. При этом передвигают чашку Петри или эмбриональный фильтр относительно окуляра стереомикроскопа слева направо или наоборот. Обнаруженные в поле зрения эмбрионы с помощью одноразового шприца (емкостью 1 см), соединенного с венозным катетером или пластиковым капилляром, переносят в маленькую чашку Петри со средой для культивирования. После просмотра всей площади дна чашки Петри или фильтра струёй жидкости с помощью шприца несколько раз перемешивают содержимое чашки, дают жидкости отстояться и просматривают еще раз.

Санитарная обработка эмбрионов Для устранения инфекционной контаминации перед пересадкой или замораживанием необходимо применять санитарную обработку эмбрионов. Для этих целей используют два способа:

1 способ. Эмбрионы проводят последовательно через ряд стерильных сред культивирования (5−10). Эмбрион микропипеткой переносят с минимальным количеством жидкости (около 0,01 см³) из одной стерильной чашки Петри в другую. При этом концентрация раствора уже в третьей чашке составляет 1/1000 исходной. Этот способ позволяет освободиться от возбудителей таких инфекционных заболеваний, как бруцеллез, лейкоз, инфекционная диарея, туберкулез, ящур, пустулезный вульвовагинит, хламидиоз и др.

От таких возбудителей заболеваний, как инфекционный ринотрахеит и везикулярный стоматит вышеописанным способом избавиться не удается, так как эти возбудители взаимодействуют с прозрачной оболочкой эмбриона и остаются на ней даже при многократных промываниях эмбриона.

2 способ. Обработке этим способом можно подвергать только эмбрионы с неповрежденной прозрачной оболочкой, предотвращающей проникновение фермента непосредственно к эмбриональным клеткам. Эмбрионы обмывают в 5 стерильных средах культивирования, затем 2−2,5 минуты в двух растворах трипсина с концентрацией 0,25%. После обработки трипсином эмбрионы вновь промывают в 5 стерильных средах культивирования. Этот способ позволяет избавиться от всех возможных возбудителей инфекционных заболеваний.

Оценка эмбрионов Характеристика состояния эмбрионов необходима для выявления среди них способных, к развитию и пригодных для пересадки реципиенту или криоконсервацид. При оценке учитывают стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяют морфологическое состояние эмбриона и, исходя из этих критериев, устанавливают его качество и пригодность для дальнейшего использования. Морфологическую оценку качества эмбрионов проводят под стереомикроскопом с увеличением в 60−80 раз.

Стадии развития эмбриона согласно международной классификации (IETS) представлены в таблице 13.4.

Таблица 13.4.

При извлечении, возможно, обнаружить эмбрионы, находящиеся только на 1−7 стадии развития.

Неоплодотворенная яйцеклетка (1) — имеет сферическую форму, окружена прозрачной, оболочкой, диаметр составляет 0,14−0,17 мм. Между прозрачной оболочкой и плазматической частью находится перивителлиновое пространство, заполненное жидкостью.

2−12-клеточная стадия (2) — имеет сферическую форму и от 2 до 12 клеток (бластомеров). Эмбрион имеет рыхлую структуру, между бластомерами нет прочных контактов.

Ранняя морула (3) — клеточная масса до 32 бластомеров, занимает большую часть перивителлинового пространства, отдельные клетки (бластомеры) хорошо различимы. Перивителлиновое пространство четко выраженоРазмер-0,14−0,17 мм.

Морула (4) - клеточная масса состоит из 33−64 бластомеров, занимает 60−70% перивителлинового пространства, бластомеры образуют компактную массу. Перивителлиновое пространство выражено четко. Размер — 0,14−0,17 мм.

Ранняя бластописта (5) — клеточная масса состоит из 65−130 бластомеров, занимает 70−80% перивителлинового пространства, в компактной массе бластомеров образуется небольшая наполненная жидкостью асимметрично расположенная полость (бластоцель). Эмбриобласт и трофобласт визуально еще плохо различимы. Перивителлиновое пространство выражено четко. Размер -0,14−0,17 мм.

Бластоциста (б) — клеточная масса состоит из 65−130 бластомеров, занимает большую часть перивителлинового пространства.

Четко выражена дифференциация внешнего слоя трофобласта и более темной и компактной внутренней массы клеток (эмбриобласта). Бластоцель хорошо выражена, перивителлиновое пространство почти полностью вытеснено. Размер-0,14−0,20 мм.

Расширенная бластоциста (7) — состоит из 131−200 клеток, внешний диаметр увеличивается в 1,2−1,5 раза. Перивителлиновое пространство полностью исчезает. Прозрачная оболочка растянута и утончена до 1/3 первоначальной величины. Трофобласт в виде уплощенной цепочки располагается непосредственно под прозрачной оболочкой. Эмбриобласт — в виде компактного скопления клеток. Размер-0,18−0,22 мм.

Морфологические критерии оценки эмбриона Прозрачная оболочка. В норме — округлой формы, прозрачная. Трещины, сколы и любые изменения формы являются отклонениями от нормального состояния эмбриона и снижают оценку его качества.

Клеточный комплекс. Нормально развивающийся зародыш имеет равномерно окрашенную клеточную массу с округлыми, одинаковой величины или с разницей не более чем 1:2 бластомерами, отчетливо видны клеточные границы. На стадии бластоци-сты клетки трофобласта и эмбриобласта четко разграничены, бластоцель сформирована. В перивителлиновом пространстве отсутствуют включения и выделившиеся бластомеры. К отклонениям относят неравномерность окраски, размеров, формы и рыхлость клеточной массы, наличие гранул и вакуолей в бластомерах, наличие в периеителлиновом пространстве различных включений и бластомеров.

Оптимальное время для получения и пересадки эмбрионов -7−8 сутки после осеменения донора, когда большинство извлеченных эмбрионов находятся на стадиях морулы или бластоцисты. Неблагоприятные условия среды могут вызывать замедление или остановку развития. Поэтому при оценке необходимо обязательно учитывать соответствие стадии развития эмбриона его возрасту. Путем морфологического сравнения выявляют нормально развитые и отставшие в развитии на 24 и более часов эмбрионы (табл. 2).

Таблица 2.

Соответствие возраста эмбриона стадии развития.

Классификация эмбрионов по качеству На основании морфологии, стадииразвития и соответствия ее возрасту эмбрионы делят на категории:

• — отличный или хороший (1) — эмбрион идеальный, сферический, симметричный, с клетками одного размера, цвета и плотности или имеет незначительные изъяны, такие, как несколько бластомеров, выделившихся из общей массы в перивителлиновое пространство, неправильная форма клеточной массы, несколько вакуолей, стадия соответствует возрасту;
• — удовлетворительный (2) — морфологическое строение имеет серьезные замечания: присутствие разрушенных бластомеров, сильная вакуолизация, неоднородное окрашивание, низкая плотность клеточной массы, наличие множества клеток в перивителлиновом пространстве, отставание развития до 24 часов;
• — плохой (3) — многочисленные вытесненные из общей массы бластомеры, нарушение межклеточных связей, дегенерированные клетки, клетки различного размера, много крупных вакуолей и гранул, отставание развития более 24 часов, частично разрушенная или деформированная зона пеллюцида.
• — мертвый, и/или дегенерировавший (4) — сильные разрушения клеточной массы, связь между бластомерами нарушена, бластомеры разных размеров, несоответствие хронологическому возрасту, сильная вакуолизация и грануляция, разрушена зона пеллюцида.

Пересадка эмбрионов Отбор реципиентов и подготовка к эмбриопересадкам Пересадки эмбрионов проводят в хозяйствах, благополучных по инфекционным заболеваниям, с хорошей организацией производства, обеспечивающей сбалансированное кормление и оптимальный уровень воспроизводства стада.

Для пересадок используют как коров, так и телок. Коров в качестве реципиентов используют не ранее, чем через 50−60 дней после не осложненного отела, не старше 7 лет, клинически здоровых, с регулярными половыми циклами нормальной продолжительности. Телки должны быть случного возраста, не старше 22 месяцев, средней упитанности, с живой массой, соответствующей стандарту породы, ни разу не осеменявшиеся. При отборе реципиентов проводят тщательное ректогенитальное обследование с целью исключения особей с неразвитыми половыми органами или наличием патологии.

Реципиентов отбирают после спонтанной охоты или синхронизации охоты простагландинами. Ярко выраженная охота при наличии всех признаков и стадий является непременным условием пригодности животного к пересадке эмбрионов. Разница в синхронности полового цикла коровы-донора и реципиента не должна превышать 24 часов.

В день пересадки эмбрионов проводят ректальное исследование состояния половых путей и яичников реципиентов. Матка и шейка матки должны быть в норме по размерам, консистенции, подвижности. Любые отклонения (огрубление стенок матки, отечность, увеличение размеров и др.) являются противопоказанием для эмбриопересадки. При исследовании яичников оценивают состояние желтого тела по размеру, форме и консистенции, а также соответствию его развития стадии полового цикла. Хорошего качества желтое тело должно иметь основание не менее 1,5 см в диаметре и ясно выраженную головку. При задержке развития желтого тела, отсутствии его, а также при наличии фолликула, кисты или другой патологии яичника пересадку эмбриона реципиенту не проводят.

После пересадки эмбриона реципиента оставляют на привязи в течение суток. Кормление и содержание реципиентов осуществляют в обычных условиях, как для стельных животных, не допуская травмирования и стрессовых ситуаций.

В группах реципиентов ведут постоянное наблюдение за возможным проявлением повторной охоты. На 60−90 дни после пересадки животных-реципиентов ректально исследуют на наличие стельности.

Оттаивание эмбрионов и подготовка к пересадке Пайету с эмбрионом быстро извлекают из сосуда Дьгоара, выдерживают на воздухе 15 секунд, затем горизонтально погружают в водяную баню (24…28°С) на 10−15 секунд (до полного оттаивания содержимого пайеты). 11осле оттаивания насухо протирают поверхность пайеты фильтровальной бумагой и, обрезав кончик ее со стороны, противоположнойпробке, вставляют этот конец в микроаспиратор или пластиковый пшриц (1 см³). Затем обрезают другой, свободный конец пайеты. Под микроскопом контролируют выход эмбриона из пайеты в стерильную чашку Петри. Обнаруженный эмбрион переносят в маленькую чашку Петри с раствором для удаления криопротектора.

Применяют два метода удаления криопротектора.