Замораживание спермы козла

• 1. Для замораживания используют эякуляты, имеющие объем не менее 0,7 см³, концентрацию сперматозоидов не менее 2,4 млрд/см'', подвижность не менее 7 баллов.
• 2. Сперму разбавляют сахарозо-желточно-глицериновой средой с кальций-натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты в соотношении 1:2 (табл. 12.8).

Таблица 12.8.

Синтетическим кредадля замораживания спермы козла.

3. После разбавления сперму выдерживают 3−4 часа при 2…5°С и затем замораживают в виде гранул на поверхности фторопластовой пластины. Фторопластовую пластину предварительно охлаждают, а жидком азоте до прекращения кипения, затем поднимают, так, чтобы она находилась в парах азота. Дают ей в течение 4−5 минут нагреться до температуры -80°С. Поверхность пластины протирают марлевым тампоном, удаляя накопившийся иней, и накапывают в лунки по 0,2 см³ разбавленной и охлажденной спермы. Как только гранулы затвердеют, пластину опускают и закрепляют на высоте 3−5 см от поверхности жидкого азота и выдерживают в таком положении 2 минуты, а затем погружают в жидкий азот. После полного охлаждения пластину вынимают и собирают гранулы замороженной спермы в емкости для хранения.

Замораживание спермы хряка.

• 1. Разбавление спермы хряка проводят в одной из синтетических сред для замораживания спермы хряка (технология ВИЖа) (табл. 12.9,12.10).
• 2. Среда должна иметь температуру 25…27°С или такую же температуру, как и сперма непосредственно перед разбавлением. Разбавляют сперму в соотношении 1:1, медленно добавляя среду и осторожно перемешивая, а затем помещают в холодильник на 4−6 часов.
• 3. Замораживание спермы хряка проводят одним из способов:

первый способ Замораживание спермы проводят на фторопластовых пластинах, помещенных в теплоизолированную ванну, в которой поддерживается определенный уровень жидкого азота.

Уровень жидкого азота устанавливают на высоте нижней поверхности фторопластовых пластин, которые кладут на специальные выступы морозильной камеры после предварительного охлаждения в жидком азоте. Для достижения температуры -500.-.120°С пластины выдерживают в морозильной камере 1 минуту, затем в лунки фторопластовой пластины раскапывают по 0,25 см³ разбавленной спермы. После заполнения лунок пластину переносят в ванну с жидким азотом и охлаждают до прекращения кипения азота. Гранулы замороженной спермы снимают с поверхности пластины с помощью специальной лопаточки.

Таблица 12.9.

Синтетическая среда для замораживания спермы хряка.

Таблица.

второй способ Замораживание спермы хряка проводят в модернизированном морозильном агрегате Н. П. Юшенко. Устройство представляет собой теплоизолированную камеру для жидкого азота, в которой установлена вращающаяся на оси шестигранная призма, гранями которой являются фторопластовые пластины с лунками.

В каждую лунку накапывают 0,25 см разбавленной спермы. После заполнения лунок пластину выдерживают две-три минуты в горизонтальном положении, затем призму поворачивают на 60°. После того, как пластина с гранулами пройдет через жидкий азот, гранулы замороженной спермы помещают в контейнер и переносят в жидкий азот на хранение.

Для разлива спермы используют аппарат А. Д. Шилова или специальный дозатор.

• 4. На контейнер со спермой крепят бирку с номером хряка, датой замораживания, серией и другими необходимыми данными.
• 5. Замороженная сперма хряка по билогическим и санитарным показателям должна соответствовать требованиям, указанным в таблице (ОСТ 10−19−203−99).

Таблица Биологические и санитарные показатели замороженной спермы у хряка.

Замораживание спермы жеребца.

1. Сперму жеребцов-производителей замораживают в соответствии с требованиями стандарта (ГОСТ-24 168 «Сперма жеребцов замороженная») в алюминиевых пакетах или в виде гранул.

Сперму жеребцов разбавляют синтетической ЛХЦЖ средой в соотношении 1:3, с подвижностью сперматозоидов не ниже 6 баллов и концентрацией 150 млн/см³

Состав ЛХЦЖ среды для замораживании спермы жеребца.

Разбавленную сперму выдерживают в холодильнике 2 часа и замораживают на поверхности сухого льда или в алюминиевых пакетах в парах жидкого азота.

Для замораживания спермы применяют широкогорлые сосуды Дьюара или стационарные хранилища и замораживающее устройство, позволяющее держать сперму на заданном расстоянии (20 мм) над поверхностью жидкого азота. Замораживающее устройство состоит из пенопластового поплавка, съемного держателя (металлическое сито), в который помещают емкости (пакеты) со спермой, металлического кольца (испарителя), предназначенного для увеличения интенсивности испарения азота.

Стандартная методика замораживания спермы жеребца После оценки по подвижности и концентрации сперму разбавляют средой ЛХЦЖ с глицерином в соотношении 1:3. Разбавленную сперму выдерживают (в холодильнике или термосе со льдом) в течение 2 часов при температуре 2…4°С, после чего замораживают в виде гранул на поверхности сухого льда либо в алюминиевых пакетах в парах жидкого азота.

При замораживании в виде гранул сперму наносят каплями при помощи стерильной пипетки или шприца по 0,2 см в лунки на поверхности сухого льда. Через 5 минут после замораживания гранулы собирают и упаковывают в алюминиевые тубы по 125−130 гранул (одна доза — 25 см³) и помещают на хранение в жидкий азот.

При замораживании над поверхностью жидкого азота сперму разливают по 20−25 см³ в охлажденные алюминиевые пакеты. Для изготовления пакета у стандартной тубы (алюминий марки А-7) отрезают торцовую часть с пробкой и один конец полученной таким образом трубки закатывают дважды. Заполненный спермой пакет закрывают, дважды закатывая другой конец трубки. При заполнении пакета спермой необходимо следить за тем, чтобы в нем не оставался воздух, иначе при оттаивании неизбежны его разрывы.

После выдержки в течение 2 часов при 2…4°С заполненные спермой пакеты помещают в замораживающее устройство, переносят в контейнер с жидким азотом и закрывают крышкой. После 5 минут выдержки в контейнере пакеты с замороженной спермой переносят в жидкий азот на хранение.

На алюминиевых пакетах, предназначенных для хранения, указывают кличку жеребца, породу, дату замораживания, серию и фамилию исполнителя.

Замораживание спермы жеребца в малых объемах (5−6 см³) с предварительным центрифугированием.

Концентрация сперматозоидов в свежеполученной сперме должна быть не ниже 200 млн/см³. Эякулят помещают в бактерицидную камеру при температуре 25…30°С и выдерживают в течение 1 часа.

После инкубации сперму центрифугируют, а течение 10−15 минут при 1500 об/мин. После центрифугировании удаляют 50−60% плазмы так, чтобы в оставшейся части спермы концентрация сперматозоидов составляла 500−600 млн/см³ и разбавляют средой ЛХЦЖ без глицерина в соотношении 1:3.

Разбавленную сперму разливают в большие пакеты, плотно закрывают, чтобы обеспечить анаэробные условия, и помещают в камеру при температуре 14…16°С на 1 час. Затем пакеты со спермой переносят в холодильную камеру с температурой 2…4°С на 1 час.

После этого сперму сливают в охлажденную мензурку и вводят глицерин из такого расчета, чтобы конечная его концентрация составляла 2,3 съемных процента. Сперму вторично расфасовывают в алюминиевые пакеты по 5−6 см, укладывают в ледяную баню при температуре 0 °C и выдерживают 25−30 минут. Затем, вытерев насухо стерильным полотенцем, пакеты помещают в замораживающее устройство и замораживают так же. как и по стандартной методике.

Замораживание спермы жеребца в малых объемах (5 см³ с применением диализа).

Свежеполученную сперму фильтруют, измеряют объем и переносят в диализатор. В качестве мембраны используют сидратцеллюлозную пленку ОБ-20 или пленку типа «купрофан». Пленку закрепляют резиновым кольцом на цилиндре так, чтобы она свисала мешочком, образуя внутреннюю камеру, куда помещается свежевзятая сперма. Камеру со спермой опускают в сосуд с диализным раствором, в качестве которого используют среду ЛХЦЖ в соотношении 1:4. Желток вводят непосредственно в сперму в количестве 3 см³ или 2 г на 100 мл, предварительно растворив в равном объеме 11% раствора лактозы.

Диализ длится 4 часа, из них 2 часа при комнатной температуре (18…20°С) и 2 часа при температуре 2…4°С. В течение этого времени диализатор необходимо периодически встряхивать, чтобы диффузия веществ шла быстрее. Затем сперму из диализатора разливают по 5 см³ в подготовленные алюминиевые пакеты и замораживают по стандартной методике.

Перед осеменением сгущенную с помощью центрифугирования или диализа сперму необходимо разбавить. Для этого к 5−6 см спермы добавляют молоко до 20−25 см³. Полученное от клинически здоровых, благополучных по инфекционным болезням кобыл молоко процеживают, доводят до кипения и охлаждают. Температура спермы после разбавления должна быть 37 °C.

Оттаивание и разбавление криокоисервированной спермы проводят непосредственно перед осеменением.

3.Замороженная сперма после оттаивания должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице Использование замороженной спермы жеребца для искусственного осеменения кобыл разрешается не ранее, чем через 30 дней после замораживания и при наличии сертификата, подтверждающего ее качество.

Таблица Показатели качества спермы жеребца после оттаивания.