Применение витамина В12

Мировая продукция витамина В₁₂ составляет 9 — 11 тыс. кг в год; из них 6,5 тыс. кг используют на медицинские цели, а остальное — для животноводства. Производство витамина В₁₂ основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий (Великобритании, Венгрии), мезофильных и термофильных меганогенных бактерий (Венгрия), а также актиномицетов и родственных форм (Италия).

В СНГ в качестве продуцента витамина В₁₂ используют Propionibacterium freudenreichii var. shermanii. Для получения витамина B₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч. в среду вносят предшественник — 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B₁₂ сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 — 5,0 при 85 — 90 °C в течение 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора 0,25% NaNO₂.

Водный раствор витамина В₁₂охлаждают, доводят рН до 6,8 — 7,0 50%-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al₂(SO₄)₃* 18Н₂О и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр — пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1,с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А1₂О₃, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 — 48 ч. при 3 — 4 °C. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Для предотвращения разложения В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CNи оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобаламинов: ампулы со стерильным раствором CN — B₁₂, приготовленного на 0,9% растворе NaCl, таблетки CN — В₁₂ и в смеси с фолиевой кислотой, таблетки, (муковита), содержащие CN — B₁₂ и мукопротеид. Лечебные препараты в ампулах: камполон, антианемин и гепавит содержат водный экстракт печени крупного рогатого скота. Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий как один из способов повышения продуктивности штамма, а также проверки и внедрения в производственные условия других продуцентов, растущих на дешевом непищевом сырье.

Промышленное получение витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий позволяет полностью удовлетворить потребности медицины. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В₁₂ используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке. Для нужд животноводства витамин В₁₂ получают, используя смешанную культуру, содержащую термофильные метанообразующие бактерии.

Установлено образование корриноидов не только в смешанной, но и в чистой культуре метанобразующих бактерий Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum при росте в присутствии Н₂ и СО₂. Содержание корриноидов у метанобразующих бактерий составляет 1,0 — 6,5 мг/г сухой биомассы. С помощью смешанной культуры метанобразующих бактерий разработан метод получения кормового препарата витамина В₁₂ — КМБ₁₂. Субстратом для метанового брожения служит ацетоно-бутиловая и спиртовая барда. Ацетоно-бутиловую барду получают в результате удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobutylicum, сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0 — 2,5% сухих веществ. К декантированной барде добавляют 4 г/м³ СоС1₂ и 0,5% метанола как стимуляторов синтеза кобаламинов. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN= B₁₂ и фактор III, обладающие биологической активностью, составляют до 80% от суммы всех корриноидов.

Исходная барда имеет температуру около 100 °C и практически стерильна. Перед поступлением в ферментеры барда охлаждается до 55 — 57 °C. В качестве исходной культуры используют смешанную культуру метанообразующих бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод. Получение концентрата витамина В₁₂ включает следующие технологические стадии: непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий, сгущение метановой бражки и сушку сгущенной массы на распылительной сушилке. Брожение проводят в железобетонных ферментерах непрерывным способом в течение года.

Важное условие нормального процесса брожения — контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота. Витамин В₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде. Поэтому перед выпариванием к метановой бражке добавляют НСl до оптимального значения рН 5,0 — 5,3 и сульфит (оптимальное содержание 0,07 — 0,1%). Перед поступлением на установку выпаривания метановая бражка дегазируется путем нагревания до 90 — 95 °C при атмосферном давлении. Бражку сгущают до 20% сухих веществ в четырехкорпусных выпарных аппаратах. Сгущенная метановая бражка высушивается на распылительной сушилке.

Сухой концентрат КМБ-12, помимо витамина В₁₂ (100 мг/кг препарата), содержит ряд других ростстимулирующих веществ. Особенно хорошие результаты в животноводстве получают при сочетании витамина В₁₂ с малыми дозами антибиотиков, в частности, с биомицином.