Микробиологический синтез триптофана

Для производства триптофана применяют как одноступенчатый синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза аминокислот, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получение предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в конечный продукт — триптофан.

У бактерий и у других организмов триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана является антраниловая кислота.

Синтез триптофана аллостерически ингибируется конечными продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты.

Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую, что достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез триптофана, но для нормального развития этих мутантов, в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты — фенилаланин и тирозин — в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана.

Для промышленного получения триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов: бактерий рода Bacillus subtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по той же схеме, что и получение лизина с помощью мутантных штаммов коринебактерий. Ферментация длится 48 ч при 37 °C, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и высушивается при 110 — 120 °C. Высушенный продукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ).

При получении высококонцентрированных препаратов триптофана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистке. Вначале ее подкисляют соляной кислотой до рН 1,0 и затем центрифугированием отделяют образовавшийся осадок. Далее центрифугат, содержащий триптофан, пропускают через ионообменные колонки с катионитом, в результате чего происходит связывание аминокислоты и, таким образом, отделение ее от культуральной жидкости. После промывки колонок производят десорбцию триптофана 5%-ным раствором аммиака в смеси изопропанола и воды. Элюат направляют на вакуум-выпарительный аппарат, после чего кристаллизуют аминокислоту при 4 — 8 °C. Выделенную в кристаллическом виде соль триптофана промывают этанолом и высушивают под вакуумом при 60 °C. Высушенный кристаллический препарат содержит не менее 99% триптофана в виде хлорида. Осадок после отделения культуральной жидкости, содержащий клетки культуры бактерий, также высушивают и используют как высокобелковую кормовую добавку, содержащую повышенное количество триптофана.

Синтез триптофана в нашей стране производится преимущественно по двухступенчатой схеме. Вначале методом химического синтеза получают предшественник триптофана — антраниловую кислоту, которую затем с участием ферментов микробного происхождения превращают в триптофан.

Биохимическое превращение антраниловой кислоты в триптофан происходит в три этапа: на первом этапе из антраниловой кислоты с участием фосфорибозилпирофосфата (ФРПФ) образуется аминогликозид-N-(5ў-фосфорибозил)-антраниловая кислота, которая в результате внутримолекулярной перегруппировки и декарбоксилирования превращается в индол-3-глицерофосфат. На последнем этапе под действием фермента триптофансинтетазы из индол-3-глицерофосфата и аминокислоты серина образуется триптофан. В связи с тем, что в качестве активной группы у фермента триптофансинтетазы служит пиридоксальфосфат, от наличия в среде этого кофермента зависит скорость превращения антраниловой кислоты в триптофан. В качестве источника ферментов используют дрожжи.

Производственный процесс биохимического превращения антраниловой кислоты в триптофан проводится в две стадии.

На первой стадии производится наращивание биомассы дрожжей, являющихся продуцентами ферментов. Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелассы, мочевины, минеральных солей. Ферментация продолжается в течение 24 ч при 30 °C. Далее в ферментер начинают вводить спиртовой 5%-ный раствор антраниловой кислоты и 50%-ный раствор мочевины. Через 3 — 4 ч после добавления антаниловой кислоты в ферментер дополнительно подается углеродный субстрат — меласса в виде 25%-го раствора. На последующих этапах ферментации периодически производится подача антраниловой кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы — через каждые 12 ч. Длительность ферментации около 120 ч, а с учетом времени наращивания биомассы дрожжей — 144 ч. Содержание триптофана культуральной среде составляет 0,3 — 0,5% (6 г/л). После выпаривания и сушки получают кормовой концентрат триптофан (ККТ), содержащий 90% сухого вещества, 48 — 54% белков, 1 — 3% триптофана, 1,5 — 1,9 мг (%) витамина В1, 2,5 — 3,3 мг (%) витамина В2, 62 — 68 мг (%) витамина РР.