Процессы с полным окислением

1. Получение лимонной кислоты.

Рассмотрим кратко производство органических кислот на примере получения лимонной кислоты. Эта кислота является интермедиатом в цикле Кребса и поэтому концентрация ее в клетках очень незначительна. Следовательно, чтобы получать лимонную кислоту в больших количествах необходимо нарушить нормальное функционирование цикла Кребса в клетке, блокировав процесс ее превращения в изолимонную кислоту. Тем самым мы предотвращаем полное окисление питательного субстрата до СО₂ и Н₂О и бурный рост биомассы продуцента. Оставшись на «голодном пайке» клетки продуцента для поддержания жизнедеятельности вынуждены интенсивно метаболизировать субстрат, что и приводит к сверхсинтезу лимонной кислоты.

Рассмотрим схему синтеза лимонной кислоты.

Лимонная кислота образуется в цикле Кребса в результате конденсации щавелевоуксусной кислоты и ацетил-КоА, катализируемой ферментом цитрат-синтазой. Для того чтобы обеспечить накопление избыточных количеств лимонной кислоты необходимо заблокировать процесс ее дальнейшего превращения в следующие кислоты цикла Кребса.

Механизм ингибирования превращения лимонной кислоты в этом процессе заключается в подавлении активности ферментов аконитазы и изоцитратдегидрогеназы в специфических условиях культивирования. Аконитаза-фермент-ферропротеид: для ее активации необходим ион Fе^+2. Поэтому процесс культивирования проводят в средах бедных ионом Fе⁺². При этом накапливающаяся в Fe⁺²-дефицитных клетках перекись водорода дополнительно ингибирует этот фермент. В среду культивирования так же добавляют гексацианоферрат калия, который, как было показано, является ингибитором другого фермента изоцитратдегидрогеназы. Кроме того, активность обоих ферментов угнетается при низких значениях рН, т. е. при накоплении кислоты в клетке. Низкое значения рН помимо ингибирования ферментов подавляет так же и развитие посторонней микрофлоры и обеспечивает асептические условия процесса [3,15,19].

Необходимая для синтеза щавелевоуксусная кислота при нормальном функционировании цикла Кребса присутствует в нем и регенерируется в конце каждого цикла. В условиях синтеза лимонной кислоты цикл Кребса блокирован и поэтому наряду с ацетил — КоА необходим постоянный подвод и щавелевоуксусной кислоты. Необходимые для реакции ацетил-КоА и щавелевоуксусная кислота образуются в клетках из двух молекул пирувата: при этом одна молекула пирувата декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА, а вторая карбоксилируется, давая щавелевоуксусную кислоту. Пируват образуется по классическому фруктозобисфосфатному пути (гликолиз) [3,7,17].

В качестве продуцента лимонной кислоты чаще всего используют A.niger.

2. Получение кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой).

Как известно тиамин (витамин В₁) в форме пирофосфатного производного является простетической группой ферментов, осуществляющих реакции расщепления и синтеза углерод-углеродных связей, находящихся между карбоксильной и карбонильной группами в молекулах б-кетокислот. Примерами таких процессов являются реакции окислительного декарбоксилирования ПВК и б-кетоглутаровой кислоты в цикле Кребса.

Большинство природных микроорганизмов способны самостоятельно синтезировать всю молекулу тиамина, однако методом мутагенеза и селекции получены виды неспособные к этому — тиамингетеротрофы или более правильно тиаминауксотрофы, нуждающиеся в добавлении тиамина к питательным средам.

При этом в зависимости от субстрата, на котором проводится культивирование, дефицит тиамина по-разному отражается на обмене веществ у тиамингетеротрофов, поскольку может происходить избирательное блокирование тех или иных процессов карбоксилирования и декарбоксилирования [4,12].

Так, при окислении глюкозы тиамингетеротрофными дрожжами рода Candida промежуточным продуктом ее превращения в ацетил-КоА является пировиноградная кислота, окислительное декарбоксилирование которой осуществляется полиферментным комплексом, включающим ТПФ-зависимую Пируватдекарбоксилазу [3].

Дрожжи, выращиваемые на глюкозной среде с дефицитом по тиамину, не могут нормально осуществлять реакцию декарбоксилирования ПВК, что приводит к торможению или блокированию образования ацетил-КоА. Следствием дефицита тиамина является выделение ПВК в культуральную среду, нарушение функционирования цикла Кребса, снижение биосинтетических процессов в клетке, приводящее к прекращению роста культуры.

При росте на среде с н-алканами ацетил — КоА образуется в результате в-окисления алифатических жирных кислот, образующихся из н-алканов, минуя стадию образования ПВК. Если в культуральной среде создается лимит по тиамину, то процессы окисления в цикле Кребса прекращаются на стадии образования б-кетоглутаровой кислоты. Это связано с тем, что блокируется функционирование другого тиаминзависимого ферментного комплекса — б-кетоглутаратдегидрогеназы, катализирующей окислительное декарбоксилиро-вание б-кетоглутаровой кислоты и образование сукцинил-КоА. Следствием дефицита тиамина является накопление б-кетоглутаровой кислоты в клетке, ее выделение в среду и замедление роста клеток. Однако зависимость клеток от тиамина в данном случае гораздо меньше. Даже при глубоком дефиците тиамина в среде — 3−4 · 10^-4 мкг/мл, что соответствует его содержанию в водопроводной воде — дрожжи растут и выделяют в среду б-кетоглутаровую кислоту до полного потребления н-алканов. Это объясняется тем, что в клетках часть молекул ацетил-КоА метаболизируется по глиоксилатному циклу. Глиоксилатный цикл позволяет клетке не только получать энергию (АТФ), и самое главное, обеспечивает расширенный ресинтез (2 молекулы на цикл) щавелевоуксусной кислоты, восполняя ее утечку с б-кетоглутаровой кислотой из ЦТК [5,11].

б-Кетоглутаровая кислота — ценный химический реагент, используемый для производства глутаминовой кислоты и некоторых гетероциклических соединений. Промышленное производство б-кетоглутаровой кислоты микробиологическим путем налажено во многих странах.