Выбор метода определения белка

Самые распространенные исследования, для которых требуется предварительное определение содержания белка, — это изучение свойств и функций белков, различные варианты хроматографического и электрофоретического разделения белков (нативный и «голубой нативный» электрофорез, электрофорез в денатурирующих условиях, двумерный и диагональный электрофорез и др.). Подчеркнем, что для всех перечисленных выше анализов имеет значение не только точность определения, но и возможность нормализовать нередко большое число образцов, различающихся как по составу белков, так и по составу буферов, для их корректного сравнения.

Одним из наиболее ответственных моментов при определении концентрации белка является выбор совместимого с анализируемым образцом метода. Поскольку все описанные ниже методы основаны на специфических свойствах белков, то и состав белкового образца, и состав буфера являются главными определяющими пригодности метода.

Состав белкового образца является решающим при выборе метода. Если в пробе преобладают белки, обогащенные аминокислотными остатками аргинина, то при определении по Bradford результаты будут завышены, тогда как при использовании методов Lowry или BCA получаются более точные результаты. Напротив, пробы c цистеин-богатыми белками будут давать завышенные результаты с BCA, а при использовании методов Lowry или Bradford значения будут ближе к истинным. В целом, если необходимо определить содержание белка в сложных белковых смесях, то предпочтительней использовать методы Lowry и BCA.

Состав буфера также очень важен. Метод Lowry высокочувствителен к такому часто используемому компоненту буферной смеси, как ЭДТА, которая мешает образованию хромофора. Метод BCA совместим с широким спектром детергентов, включая додецилсульфат натрия (ДДС-Na), но не допускает восстановителей, например, дитиотрейтола (ДТТ). Метод Bradford не подходит для высоких концентраций детергентов, но вполне употребим для использования в присутствии восстановителей, таких как ДТТ или 2-меркаптоэтанол. В таблице приведены наиболее распространенные соединения и их предельно допустимые концентрации, которые могут мешать определению белка тем или иным методом. Если подобрать подходящий метод для конкретной буферной системы не удалось, то необходимо избавиться от мешающих определению соединений, например, осаждением белка, после чего белок можно растворять в соответствующем буфере.