Методы выделения и анализа полисахаридов

Выделение полисахаридов клеточной стенки.

Обработка ксилеммы. Первое — механическое растирание на мельнице для того что бы получит муку, так как так лучше будет удаляться не прочно связанные вещества с целлюлозой и лучше растворяться. Второе — экстракция пектина и гемицеллюлозы с хелатирующими и щёлочными растворами[29].

Вначале идет отчистка клеточной стенки от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.

Удаление пектиновых веществ осуществляется с помощью оксалата аммония, как известно пектиновые вещества связаны между собой ионами Са, а оксалат аммония является хелатирующим веществом, которое связывается с ионами Са и пектиновые вещества отделяются от целлюлозы. Для удаления оксалата аммония и пектиновых веществ из колбы осуществляется центрифугирование их 3 раза с водой.

Обработка клеточной стенки ксилемы 4% NaOH позволяет извлекать гемицеллюлозные вещества, которые не извлекаются оксалатом аммония. Таким образом, с помощью 4% NaOH отделяем целлюлозу от гемицеллюлозных веществ. Затем снова удаляется щелочь и гемицеллюлозные вещества с помощью метода центрифугирования при этом проверяется Рн универсальной лакмусовой бумажкой, промыванием до нейтрального [28,29].

Выдерживание в воде «отчищенной» ксилемы необходимо для так называемой активации, без этого этапа целлюлоза не растворяется. Выдерживание в ацетоне и ДМА необходимо для полного удаления воды, так как при наличие воды целлюлоза выпадает в осадок. Клеточную стенку волокна растворяют в 8% растворе LiCl в ДМА, и заново осаждают целлюлозу путём добавления воды. Осаждение в воде необходимо для того что бы фермент полностью расщепил целлюлозу, если опустить этот этап то целлюлоза плохо будет подвергаться гидролизу. 8% раствор LiCl в ДМА используются так как они вместе являются хорошими растворителями целлюлозы и не реагируют с ней, к тому от них легко избавиться с помощью хроматографии. Раствор отделяют от целлюлозы (Фильтрат 1). Целлюлозу суспензируют в содержащем целлюлoзу ацетатном буфере. В течение 1−2 суток фермент растворяют осаждённую целлюлoзу (Фильтрат 2). Получают раствор прочно связанных полисахаридов с целлюлозой. Далее с помощью ТФУ разрушаются все гликозидные связи и при высушивaнии весь ТФУ испаряется, и остаются мономеры сахаров. Dionex эта ионно-обменная хроматография, на ней определяют моносахаридный состав, заранее вкалываются стандарты моносахаров по которым, опознается конкретный моносахарид.

В дальнейшем планируется провести ЯМР анализ и определить тип связующих гликанов.

Таким образом, отчистив клеточную стенку от пектиновых и гемицеллюлозных веществ.

• — Получают раствор прочносвязанных с целлюлозой полисахаридов.
• — Разделяют его на фракции по молекулярным массам.
• — Определяют моносахаридный состав во фракциях [28,29].

Общая методология выделения и очистки полисахаридов При выделении отдельных полисахаридов нужно рeшaть три задачи разной степени сложности (следует отметить, что они редко являются последовательными этапами выделения):

• 1) разделение от низкомолекулярных веществ;
• 2) отделение биополимеров неуглеводной природы.
• 3) разделение смесей полисахаридов[29].

При выборе метода для решения очередной задачи следует учитывать те свойства целевого биополимера, по которым он отличается от других компонентов исходной смеси; эти различия и должны выявляться посредством применения искомого метода. Описан ряд параметров, на основании которых возможно произвести разделение веществ: молекулярный вес, растворимость, температуры плавления и кипения, способность вступать в качественные реакции с определёнными соединениями и т. п.; большинство из них зависит от химической структуры веществ [29,30].

Основной функциональной группировкой полисахаридов является гидроксильная группа, превращения которой (прежде всего, окисление и образование простых и сложных эфиров) оказывают значительное влияние на условия процесса выделения полисахарида. Другие функциональные группы также подвержены различным модификациям: карбоксильные группы уроновых кислот могут быть этерифицированы или восстановлены, аминогруппы аминосахаров — ацилированы, и др[29].

Полисахариды высокополярны ввиду наличия большого количества гидроксильных групп. Соответственно, растворимость полисахарида должна быть прямо пропорциональна полярности растворителя. Все полисахариды плохо растворимы в формамиде и диметилсульфоксиде и практически нерастворимы в спиртах, однако растворимость в воде определяется не только полярностью, но и степенью упорядоченности строения макромолекулы[30]. Некоторые внеклеточные полисахариды с регулярной структурой и линейной конформацией обладают высокой энергией межмолекулярного взаимодействия, превосходящей энергию гидратации; поэтому эти соединения всего лишь слабо набухают в воде [31]. Полисахарид разветвлённого строения (например, разветвлённые пектиновые кислоты) существует в водных растворах в виде беспорядочно свёрнутого рыхлого клубка и, благодаря большим размерам и гибкости макромолекул, связывает огромное количество растворителя (объём такого клубка во много раз превышает изначальный объём макромолекулы). Кроме того, полисахариды склонны к образованию ассоциаций в растворах за счёт межмолекулярных водородных связей; при малых объёмах жидкости это может привести к возникновению нерастворимых форм.

Вне зависимости от природы целевого соединения процесс должен быть максимально эффективным, т. е. обеспечивать максимальный выход продукта; полисахарид не должен подвергаться деструкции под воздействием химических реагентов, использованных для его выделения, либо ферментов, присутствующих в составе сырья.

Экстракция. Метод экстракции подразумевает извлечение веществ, содержащихся в сырье, в раствор, и используется как начальный этап очистки. Возможно два варианта экстракции:

1) Растворение полисахарида и ряда сопутствующих веществ и отделение нерастворимых примесей. Таким образом, получают растительные слизи и некоторые бактериальные экзополисахариды. Чаще всего в качестве растворителя используют воду, однако полисахариды с большим количеством кислотных функциональных групп лучше растворяются в разбавленных минеральных кислотах, а гемицеллюлозы экстрагируют в щелочной среде.

Экстракция полисахаридов сопровождается растворением полярных низкомолекулярных соединений, некоторых белков и нуклеиновых кислот, поэтому дальнейшая обработка экстракта предусматривает удаление этих веществ.

2) Выделение полисахарида из смеси в виде осадка. Так, хитин и целлюлоза сохраняют целостность структуры при жёсткой щелочной или окислительной обработке, которая приводит к деструкции остальных биополимеров.

Экстракция требует предварительного измельчения сырья; при этом часть фибриллярных молекул может быть повреждена либо механическим путём, либо окислением кислородом воздуха (последнее — в щелочной среде).

Осаждение. Перевод вещества из раствора в осадок можно осуществить несколькими путями:

• 1) Нагревание экстракта / исходной смеси с последующим охлаждением. В ходе данной процедуры выпадают в осадок полисахариды, растворимость которых в горячей воде значительно выше, чем в холодной: в-глюкан из овса, инулин и др.
• 2) Осаждение органическим растворителем, смешивающимся с водой. Обычно применяют 80% этанол, который растворяет низкомолекулярные примеси, в т. ч. олигосахариды, в то время как полисахариды выпадают в осадок.
• 3) Фракционное осаждение. В этом случае получают серию фракций осаждаемых веществ, соответствующих разным концентрациям осадителя в растворе; в каждой фракции содержание целевого полисахарида выше, чем в предыдущей. Данный способ может быть пригоден для разделения смеси полисахаридов. Например, кислые полисахариды могут быть отделены от нейтральных в виде нерастворимых кальциевых или бариевых солей.
• 4) Добавление комплексообразователей. Остатки уроновых кислот и моносахаридов с соседними гидроксильными группами образуют нерастворимые комплексы с ионами меди; высокомолекулярные комплексообразователи (амилоза) взаимодействуют таким же образом с целлюлозой, и т. п. [29].

В результате осаждения полисахаридов из первичных экстрактов часто получают смеси, загрязнённые неуглеводными примесями, в первую очередь белком и неорганическими солями, поэтому необходимо подвергнуть экстракт предварительной обработке посредством диализа, ультрафильт-рования или ферментативной очистки.

Диализ. В процессе диализа раствор экстракта помещают в целлофан, погружённый в воду; при этом низкомолекулярные примеси диффундируют через целлофан наружу. Диффузия ускоряется под действием электрического поля (электродиализ) или при перемешивании. Для удаления катионов из растворов кислых полисахаридов диализ проводят в подкисленной среде.

Ультрафильтрование представляет собой фильтрование раствора через полупроницаемую мембрану с определённой величиной пор и так же позволяет избавиться от низкомолекулярных примесей.

Ферментативная обработка разрушает высокомолекулярные примеси, которые не удаётся удалить при помощи диализа. Очистка раствора от использованного фермента осуществляется одним из методов денатурации белков: нагревание, действие химических реагентов (щёлочи, трихлоруксусной кислоты, хлороформа с амиловым спиртом и т. д.), избирательная сорбция белков на геле фосфата кальция[29]. Такие методы применяются для деструкции неферментных белков, загрязняющих раствор[31].

Хроматография — разделение веществ, различающихся по определённым физико-химическим параметрам.

Bид хроматографии, основанный на разделении веществ по молекулярному весу — гель-фильтрация на сефандексе. Сефандекс — полусинтетический сорбент полисахаридной природы; его гранулы содержат поры и формируют т. Н. «молекулярное сито», которое задерживает внутри низкомолекулярные вещества и не препятствует диффузии полимеров. Существуют наборы сефандексов с различной величиной пор для разделения смеси полисахаридов. Так получают декстраны[29].

Ионообменная хроматография позволяет разделить вещества в соответствии с их зарядом (например, отделить кислые полисахариды от нейтральных). Ионообменник — это твёрдый носитель заряженных групп, которые способны за счёт электростатистического взаимодействия связывать ионы исследуемых молекул. Таким образом, заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником и могут быть элюированы для дальнейшей обработки[31].

Pаспределительная и адсорбционная хроматография не нашли широкого применения в области получения полисахаридов[29].

Распределительная хроматография выявляет разную подвижность исследуемых веществ при распределении последних между двумя фазами, стационарной (матрикс, носитель, сорбент) и мобильной (растворитель, проявитель). Адсорбционная хроматография может разделить вещества в том случае, если при одинаковых концентрациях они демонстрируют разную степень связывания с сорбентом[31]. Проблемы, которые возникают при использовании данных видов хроматографии при работе с растворами полисахаридов, обусловлены склонностью последних к межмолекулярной ассоциации и образованию коллоидных растворов.

Электрофорез основан на способности веществ, имеющих заряженные группы атомов, двигаться в растворителе под действием электрического поля [31].

Использование данного метода ограничено сложностью подбора условий эффективного разделения (состав буферной смеси, концентрация растворителя, сила тока, продолжительность фореза и др.). Тем не менее, электрофорез успешно используется для отделения сульфированных полисахаридов от полиуронидов водорослей, маннаны от глюканов Candida albicans и компоненты других гетерогенных полисахаридных смесей[29].

Ультрацентрифугирование (седиментация) обеспечивает концентрационное распределение веществ по центрифужной пробирке под действием центробежной силы. Измерение длины траектории движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определением скорости седиментации; зная эту величину, можно вычислить коэффициент седиментации — показатель, значение которого зависит от молекулярной массы и формы частицы[31].

Процесс выделения полисахаридов так же можно облегчить путём изменения поверхностных свойств продуцируемого вещества (например, за счёт удаления поверхностного полимерного материала типа липополисахаридов). При этом надо помнить, чтобы клеточный материал не выходил из периплазматического пространства; необходимо также избегать лизиса клеток с последующим загрязнением конечного продукта.

Часто есть опасность при выделении полисахаридов деструкции под действием ферментов. Растворы полисахаридов могут служить средой для роста микроорганизмов, попадающих туда из воздуха лаборатории. Для предотвращения расщепления полисахаридов ферментами микроорганизмов к растворам прибавляют толуол, тимол или хранят их при низкой температуре[31].

Особенности выделения и очистки некоторых полисахаридов.