Специальная часть. 
Ассоциативные микроорганизмы насекомых – представителей подотряда цикадовые (Cicadinea)

Материалы исследования

Работа проводилась на кафедре микробиологии и физиологии растений биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского. Было исследовано 60 особей имаго представителей подотряда Cicadinea и 10 проб растительного материала Brachypodium pinnatum, являющиеся основной кормовой базой для изученных особей.

Поиск объектов проводился в июле 2012;2013 годов в окрестностях озера Став г. Энгельса и с. Сабуровка Саратовского района Саратовской области методом кошения энтомологическим сачком в густой травянистой растительности. Среди пойманных образцов было отобрано 3 вида насекомых, относящихся к 2 семействам подотряда цикадовые (табл. 1, 2).

Таблица 1 — Объекты исследования с. Сабуровка 2013 г.

Таблица 2 — озеро Став г. Энгельс 2012; 2013 г.

Методы исследования

Непосредственно перед бактериологическим посевом в лаборатории насекомых выдерживали в закрытом сосуде с ваткой эфира в течение 5 мин. После чего поверхность каждого насекомого обрабатывали спиртом для исключения попадания посторонних микроорганизмов с покровов тела. Далее под бинокуляром с помощью скальпеля и иглы отделяли пищеварительный тракт насекомых. Пищеварительный тракт гомогенизировали в ступке с 5 мл физиологического раствора и высевали по 0.1 мл суспензии на питательные среды (ГРМ-агар, картофельная среда (КС)) (ссылка на методичку).

Отдельные образцы из каждой группы насекомых были заспиртованы в колбочках и отданы для определения систематического положения профессору, доктору биологических наук Василию Викторовичу Аникину.

Помимо этого был исследован растительный сок и поверхность листовых пластинок основного кормового растения для изучаемых насекомых — Brachypodium pinnatum. Было отобрано 10 проб растительного материала с разных участков обитания цикадок на закрепленной территории. Это растение, русское название которой Коротконожка перистая, было выбрано не случайно, по нашим наблюдениям именно на данном растении мы обнаруживали наибольшее количество особей представителей подотряда цикадовых.

Бактериологический посев проводили с поверхности листа методом отпечатка на чашки Петри с ГРМ-агаром и средой КС. После этого листья промывали в спирте в течение 5 минут, затем дважды промывались в физиологическом растворе в течение 2 минут, после чего 0.1 г растирали в ступке с 0.9 мл физиологического раствора. Полученную гомогеннную суспензию засевали на ГРМ-агар и картофельную среду. Посевы культивировали при 28єC в течение 3 суток.

В дальнейшем проводился количественный учет выросших колоний микроорганизмов и отсев выделенных штаммов на скошенные питательные среды. В дальнейшем были изучены морфологические, культуральные и биохимические свойства выделенных изолятов. При изучении биохимической активности определялось наличие у них каталазы и оксидазы, выявлялась их способность использовать различные сахара (глюкозу, сахарозу, маннит, лактозу, ксилозу, арабинозу, маннозу), цитрат, способность к гидролизу крахмала, желатины, казеина, продукции сероводорода, аммиака и индола, ацетоина, способность к азотфиксации, к ассимиляционной и диссимиляционной нитратредукции. При определении устойчивости выделенных штаммов к абиотическим факторам определялась их способность к росту при различных pH среды (рН 5, 6, 9, 10), концентрациях NaCl в среде (2, 5, 7, 10, 15%), действию температурного фактора (+10 и +43°С). Постановка всех тестов осуществлялась по общепринятым методикам [102].

Первоначальную идентификацию выделенных ассоциантов проводили по фенотипическим признакам [103, 104, 105. 106, 107]. Видовая принадлежность доминирующих штаммов подтверждена секвенированием 16S рРНК в сервисной лаборатории «Синтол» (г. Москва).