Хроматографические методы идентификации флавоноидов

Избирательная экстракция для флавоноидов имеет важное значение в связи с широким использованием для их разделения и очистки различных вариантов хроматографического метода.

В настоящее время используют различные варианты хроматографического метода. Наиболее важной в качественном анализе является распределительная хроматография на бумаге. Тонкослойный вариант удобен для разделения ароматических оксикислот и метилированных флавоноидов, которые с трудом делят на бумаге.

Метод жидкостно-жидкостной хроматографии и, особенно, ВЭЖХ позволяет осуществлять качественный и количественный анализ всех видов флавоноидов.

Для разделения флавоноидов между собой и отделения от сопутствующих веществ используется адсорбционно-хроматографический метод[10].

Тонкослойная хроматография Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) очень удобен для сравнительного анализа с использованием стандартных веществ.

Пятна флавоноидов на хроматограмме зачастую могут быть обнаружены просто при облучении пластинки УФ-светом. Широко используются методы обработки хроматограмм такими проявляющими (детектирующими) реагентами, как спиртовый раствор АlCl₃, пары иода и концентрированная серная кислота (для силикагелевых слоев), а также нагревание (только для силикагелевых пластинок).

Специфическим для хроматографии флавоноидов является полиамидный сорбент. Полиамидный сорбент (стационарная фаза), в зависимости от состава подвижной фазы, может проявлять двойственный характер, а именно выступать в роли полярной или неполярной фазы.

Соответственно разделение веществ может протекать либо как обычный распределительный (в водно-спиртовых элюентных системах), либо как обращенно-фазный распределительный (в элюентной системе метанол — хлороформ) процессы.

Центром сорбции является амидная группировка полиамидной макромолекулы, например капрона. Хроматографируемые вещества образуют обратимые водородные связи между протонодонорной гидроксильной группой флавоноидного соединения и карбонильной группой амидного фрагмента.

Агликоны сорбируются на полиамиде прочнее, чем их гликозиды. Сорбция агликонов находится в пропорциональной зависимости от числа гидроксильных групп в молекуле, а также от их местоположения в молекуле[11].

Высокоэффективная жидкостная хроматография Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения.

Для флавоноидов более употребительны колонки с обращенно-фазными сорбентами (RP-8; RP-18) и детектирование с помощью УФ-видимого детектора с переменной длиной волны. В настоящее время широко используется фотодиодный детектор, позволяющий одновременно с выделением пика на хроматограмме получать УФ-видимый спектр вещества, соответствующего этому пику. Такой экспериментальный прием значительно облегчает задачу идентификации веществ.

Подвижные фазы (элюентные системы), как правило, бывают бинарными и содержат подкисленный полярный компонент (водные растворы уксусной, перхлорной, фосфорной или муравьиной кислот) и менее полярный органический растворитель (метанол или ацетонитрил).

Соотнесение пика на хроматограмме с «принадлежащим» ему веществом является наиболее трудной задачей. Удобным приемом является использование параллельного хроматографирования хорошо известных, так называемых стандартных образцов и сравнение с ними хроматограммы исследуемого объекта. Стандартное вещество в идеале должно быть наиболее родственно флавоноидам и иметь подобные хроматографические свойства. В тех случаях, когда стандартное вещество хроматографируется в равных условиях, но параллельно, его называют внешним стандартом. Внутренний стандарт (добавляется в исследуемую пробу перед вводом в хроматограф) должен отвечать следующим условиям: в исследуемой смеси не должно содержаться аналогичное вещество и пик стандарта не должен перекрываться с каким-либо соединением в смеси. Такие ограничения отсутствуют в случае применения внешнего стандарта.

Преимуществами внутреннего стандарта является подтверждение достоверности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид — для флавоновых гликозидов, катехин — для флаван-3-олов, нарингенин — для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин — для дигидрофлавонолов, даидзеин — для изофлавонов.

Для количественного анализа строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков.

На примере хроматографирования смеси флавонов и флавонолов в обращенно-фазном варианте (рисунок 5) показано, что порядок выхода флавоноидов коррелирует с числом гидроксильных групп, а именно: время удерживания возрастает по мере снижения числа гидроксильных групп в молекуле.

Хроматографические условия: колонка Sep-Pak C-18, градиентный режим: метанол — 5 мМ, H₃PO_4.

Рисунок 5 — Хроматограмма смеси флавоноидов.