Вопросы для самоконтроля

• 1. История изучения культуры клеток и тканей
• 2. Методы культивирования изолированных тканей и клеток организмов
• 3. Правила асептики при культивировании in vitro
• 4. Требования к питательным средам при культивировании изолированных тканей и клеток
• 5. Влияние физических факторов на рост и развитие растительных тканей in vitro
• 6. Дифференцировка каллусных тканей
• 7. Направления развития каллусных клеток

Лекция 2. Использование метода культуры клеток и тканей в создании современных технологий

Области применения метода культуры клеток и тканей

Метод культуры тканей широко используется в сельском хозяйстве и промышленном производстве (рис. 30). Примером может служить массовое клональное микроразмножение плодовоовощных и декоративных растений, а также их оздоровление от вирусных и других инфекций. С помощью культуры in vitro можно расширить возможности селекционной работы: получать клоны клеток, а затем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты возникла отрасль промышленности, осуществляющая биологический синтез веществ, необходимых человеку.

В настоящее время известно примерно 2 10⁴ синтезируемых растениями веществ, которые используются человеком, и их количество постоянно увеличивается. Растения всегда служили источником пищи, эфирных масел, красителей и, конечно же, лекарственных соединений. Так, мак снотворный (Рараvеr sоттnifеrит) является источником болеутоляющего вещества — кодеина; из наперстянки (Digitalis lапаtа) получают дигоксин, тонизирующий сердечную деятельность; из хинного дерева (Сinсhопа ledgеriапа) — антималярийное средство «хинидин». Особое место занимают наркотики и стимулирующие вещества. В небольших, строго контролируемых количествах их используют в медицине.

Однако при систематическом употреблении низких концентраций наркотиков возникают наркозависимость и стремление к увеличению употребляемой дозы. Применение высоких концентраций наркотика убивает человека. Наиболее известны опиум и героин из Рараvеr sоттnifеrит, кокаин из Erythroxylon, никотин из различных сортов табака. Наиболее известный стимулятор — кофеин, содержащийся в растениях чая и кофе. Стимуляторы не токсичны в концентрациях, рекомендуемых к применению. Однако высокие их концентрации негативно влияют на сердечно-сосудистую и нервную систему человека.

Большой интерес вызвало открытие пиретринов, выделенных из цветков Сhrуsапthemum cinerariaefolium. Эти вещества — мощные инсектициды. Особая их ценность заключается в том, что пиретрины не вызывают привыкания у насекомых, а также не проявляют кумулятивного токсического эффекта.

Способность растений синтезировать различные соединения привела к предположению, что тем же свойством будут обладать клетки и ткани этих растений, выращиваемые в стерильных условиях. Для некоторых культур это оказалось справедливым, Но в отдельных случаях клетки либо не проявляли способности к синтезу необходимых веществ, либо синтезировали их в минимальных количествах. Понадобились долгие эксперименты по подбору питательных сред, условий культивирования, исследованию новых штаммов, полученных благодаря генетической гетерогенности каллусных клеток или применению мутагенных факторов чтобы добиться серьезных успехов в этой области.

В настоящее время промышленный синтез вторичных метаболитов — очень перспективное направление. Синтез вторичных метаболитов происходит главным образом в суспензионной культуре клеток, в регулируемых условиях, поэтому он не зависит от климатических факторов, от повреждения насекомыми. Культуры выращивают на малых площадях в отличие от больших массивов плантаций с необходимыми растениями. Культуры клеток растений могут синтезировать практически все классы соединений вторичного обмена, причем довольно часто в количествах, в несколько раз превышающих их синтез в целых растениях. Например, выход аймалицина и серпентина в культуре клеток Саtharanthus roseus составляет 1,3% сухой массы, а в целом растении — 0,26%. В культуре клеток Dioscorea deltoidea диосгенин синтезируется в количестве 26 мг на 1 г сухой массы, а в клубнях растений его содержание составляет 20 мг на 1 г сухой массы. Кроме того, в культурах клеток может начаться синтез веществ, не характерных для исходного растения, либо расширяется набор синтезируемых соединений. В ряде случаев в клеточной культуре образуются вещества, которые синтезировались интактным растением на ювенильной фазе развития, либо вещества, содержавшиеся в клетках филогенетически более ранних групп растений. Так, в культуре клеток Рараvеr bracteatum содержится сангвирин, характерный для ювенильных растений, и отсутствует тебаин, синтезируемый взрослыми растениями.

Важная особенность культивируемой популяции клеток — ее стабильность в отношении синтеза и накопления продуктов вторичного синтеза. Так, российскими учеными были получены разные штаммы клеток Dioscorеа deltoidea, в том числе штамм-сверхпродуцент ИФР ДМ-0,5. Все эти штаммы сохраняли стабильность в отношении синтеза фуростаноловых гликозидов около 26 лет. Интересная особенность большинства клеток в культуре состоит в том, что обычно эти клетки не транспортируют синтезируемые метаболиты в питательную среду или другие клетки, хотя некоторые культуры составляют исключение, в частности культура клеток мака, которые депонируют алкалоиды в млечники. Синтез вторичных метаболитов в культивируемых клетках связан с внутриклеточными органеллами, в основном с пластидами и эндоплазматическим ретикулумом. В клетках, не способных к транспорту метаболитов, продукты вторичного синтеза обычно накапливаются в вакуолях и свободном пространстве клеток.

На синтез вторичных метаболитов влияет целый ряд факторов. Прежде всего, выход продукта зависит от генотипа растения-донора. Показано, что культуры клеток, полученных от высокопродуктивных растений, продуцировали большее число метаболитов. Другой важный фактор — состав питательной среды и концентрация ее компонентов, которые должны обеспечивать, с одной стороны, увеличение количества клеток-продуцентов, с другой — усиливать сам процесс синтеза. На рост, т. е. на увеличение биомассы, существенно влияет природа и количество углеводов, соединений азота и фосфора, на синтез метаболитов — природа и концентрация фитогормонов. Так, при замене одного ауксина на другой, например нафтилуксусной кислоты на 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту), трехкратно увеличился синтез антрахинона суспензионной культурой Morinda citrifolia.

Существует современная технология получения вторичных метаболитов с помощью иммобилизованных клеток культуры, т. е. помещение их в определенный носитель или адсорбция в нем. Носитель с клетками помещают в питательную среду. Клетки остаются живыми. Они прекращают рост, но продолжают синтез метаболитов, выделяя их в среду.

Еще один из примеров использования вторичных метаболитов растений — получение карденолидов, гликозиды которых используют в медицине для лечения болезней сердца. Растения наперстянки (Digitalis lanata) в большом количестве синтезируют дигитоксин вместо необходимого дигоксина. Для соответствующей биотрансформации с успехом используют недифференцированную суспензионную культуру наперстянки. Иммобилизованные клетки этой культуры способны долгое время с постоянной скоростью трансформировать в-метилдигитоксин в в-метилдигоксин.

Таким образом, использование суспензионных культур для синтеза вторичных метаболитов в промышленных масштабах имеет большие перспективы, и не только с точки зрения экономической выгоды получения более дешевой продукции в запланированных количествах. Важно, что использование культуры клеток спасет от уничтожения тысячи дикорастущих растений, ставших уже редкими, которые синтезируют необходимые человеку вещества. Увеличение выхода продукта может быть достигнуто благодаря дальнейшей исследовательской работе по селекции специализированных популяций клеток и оптимизации условий культивирования. Большой интерес представляет также дальнейшее развитие методов биотрансформации метаболитов и иммобилизации культивируемых клеток.

Достаточно успешно развиваются с помощью технологий клеточной инженерии, культуры клеток и тканей ускорение и облегчение селекционного процесса, создание растений с новыми качествами, а также клональное микроразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных инфекций и криосохра-нение генофонда — технология, в настоящий момент приобретшая экологическую направленность.