Колоночная хроматография. 
Физико-химические методы определения стероидных гормонов

Хотя колоночную хроматографию нельзя рассматривать как прямой метод количественного анализа стероидов.

В большинстве упомянутых публикаций колоночная хроматография использована для определения стероидов в сложных биологических объектах, но она широко применяется и для разделения стероидов в лекарственных препаратах.

Поскольку стероиды — это соединения средней полярности, для их разделения применяется широкий круг адсорбентов и систем растворителей.

Все адсорбенты, предложенные в классический период развития хроматографии стероидов, такие, как силикагель, кизельгур, оксид алюминия и силикат магния (флорисил), используются и до сих пор. Чтобы добиться разделения родственных стероидов или выделения всех стероидов из сложных смесей, адсорбенты часто пропитывают солями серебра. Например, Пеннер для выделения хингестанола и продуктов его разложения из сезамового масла в качестве адсорбента использовали флорисил, обработанный аммиачным раствором нитрата серебра, и в качестве элюента этанольный раствор хлорида аммония.

Ионообменная хроматография пригодна не только для разделения кислых стероидов, как, например, эстрогенов и их производных, она широко применяется для выделения (или, как часто говорят, экстракции) нейтральных стероидов из биологических проб. Для этих целей почти всегда используется стиролдивинилбензольная смола амберлит XAD-2. Например, Эггер и др. выделяли стероиды, содержащиеся в моче, непосредственно после их ферментативного гидролиза на колонке размером 600×20 мм, заполненной XAD-2 и промытой 5%-ным водным раствором хлорида натрия. Стероиды вымывали из колонки метанолом; полученный раствор пригоден для установления профиля концентраций стероидов методом капиллярной газовой хроматографии.

Наиболее важным моментом в развитии колоночной хроматографии стероидов в последнее десятилетие следует считать введение гель-проникающей хроматографии, которая сейчас чаще всего применяется при подготовке биологических проб для количественного анализа методами газовой хроматографии, радиоиммунными методами и др. Первоначально использовали (а часто используют и сейчас) полидекстрановые гели, например сефадекс G-25 и G-10, но впоследствии было найдено, что путем уменьшения их полярности, например связывая свободные оксигруппы сефадекса G-25 с образованием оксипропилпроизводных, можно добиться лучших результатов. Для разделения и очистки стероидов разной полярности чаще всего применяют сефадекс LH-20.

Сефадекс LH-20 особенно удобен при разделении стероидов с близкой полярностью. На рис. 19 приведен характерный пример — кривая элюирования восьми эстрогенов, взятая из статьи Лисбоа и Страсснера.

Для разделения менее полярных стероидов в последние годы все шире и шире используются оксиалкоксипропилпроизводные сефадекса LH-20 (липидекс). На рис. 20 показано разделение стероидов на короткой колонке, заполненной липидексом.

В отдельных случаях с особой целью были получены специальные производные сефадекса LH-20. Аксельсон и Сьявалл описали избирательную сорбцию слабоосновных метоксимов стероидов на сульфоэтил-LН-20 и разделение стероидов на нейтральную и фенольную фракции на триэтиламиноокси-лропилоксилалкил-сефадексе LH-20.

Рис. 20. Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см*0,4 см) с липидексом

Столь же общеупотребительным является диэтиламиноэтильное производное сефадекса (DEAE-сефадекс) для разделения кислых стероидов.

Недавно группой исследователей под руководством Адлеркройца показана возможность комбинированного использования нейтральной и ионообменной колонок, заполненных сефадексом. При установлении профиля концентрации стероидов, содержащихся в моче (в основном эстрогенов), они применяли сефадекс G-25 для разделения стероидов и сефадекс LH-20, а также ОН^- и ОАс^-формы DEAE-сефадекса А-25 в качестве анионообменника для очистки и фракционирования стероидов; кроме того, описано применение колонки с липидексом 5000 для очистки триметилсилилированных стероидов перед их количественным определением методом газожидкостной хроматографии.

Наиболее важными причинами необычайно быстрого распространения и высокой популярности в аналитической химии стероидов колонок, заполненных сефадексом, являются низкие и воспроизводимые значения холостых опытов, хорошая воспроизводимость объемов элюирования и высокий процент выделения.

Распределительная жидкость-жидкостная хроматография использовалась уже в ранний период развития хроматографии стероидов и все еще применяется в настоящее время, особенно в фармацевтике. В качестве неподвижной фазы на носителях диатомитах (в основном целите 545) служат различные полярные растворители, как, например, вода, водный раствор гидроксида натрия, формамид, этиленгликоль, ацетонитрил и т. п., а подвижной фазы — несмешивающиеся с ними неполярные растворители. В качестве примера можно упомянуть колонку, заполненную целитом и с ацетонитрилом в качестве подвижной фазы, описанную Грэхемом и др. Получены параметры удерживания 44 стероидов при элюировании н-гептаном и хлороформом; эту систему успешно применяли для решения различных задач разделения, в том числе разделения эфиров тестостерона и свободного тестостерона с последующим количественным анализом элюатов методами УФ-спектрофотометрии или колориметрии. К одному из последних достижений в распределительной колоночной хроматографии стероидов относится разработка химически связанной обращенной фазы с группами C₁₈(Sep-Pak) (Хейккинен и др.) для экстракции эстрогенов мочи и (Шеклтон и др.) извлечения других стероидов. Из специальных хроматографических методов отметим гель-фильтрацию для определения свободных прогестерона, тестостерона и эстрадиола в плазме.

Введение

многоколоночных и многодетекторных систем, автоматизация и применение ЭВМ значительно повысили роль колоночной хроматографии в анализе многочисленных многокомпонентных смесей стероидов. 6].