Влияние стволовых клеток на иммунный ответ у мышей BALB/с, зараженных вирусом лейкоза Раушера и переносимость препаратов субалин

ВЛИЯНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ИММУННЫЙ ОТВЕТ У МЫШЕЙ BALB/с, ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА РАУШЕРА И ПЕРЕНОСИМОСТЬ ПРЕПАРАТОВ СУБАЛИН И СИЛЬВЕРОЛ

Я. Л. Русакова С. Н. Магер В. В. Храмцов Модель лейкоза Раушера — это модель экспериментального лейкоза вируса Раушера (RLV-вирус), вызывающего у мышей эритробластоз, реже лимфолейкоз или миелолейкоз [1]. Инфекция восприимчивых мышей, таких как BALB/c, вирусом Раушера приводит к быстрой, постоянной виремии, пролиферации эритроидных клеток-предшественников, анемии и спленомегалии [2, 3]. Особенности иммунологического ответа при лейкозе Раушера у мышей изучены недостаточно. Известно, что восприимчивость к лейкемии Раушера контролируют, по крайней мере, два гена. Некоторые исследователи, например В. Morse, указывают на медленное прогрессивное ухудшение эритропоэза у мышей BALB/c, зараженных RLV, развивающуюся гипохромную анемию, неэффективный эритропоэз и инфильтрацию печени, селезенки, периферической крови эритроидными клетками-предшественниками.

В своих работах, посвященных изучению гемопоэза мышей, инфицированных вирусом лейкоза Раушера, de N. J. Both с соавт. наблюдали через 5 дней после заражения возникновение лейкемических островков в красной пульпе, которые быстро распространялись по всей селезенке, и, спустя 3 недели после инфекции, приблизительно 60% селезенки состояли из больших незрелых эритробластоподобных клеток [6]. Отмечали также тромбоцитопению [7]. Есть исследования, подтверждающие, что важную роль в защите организма против этого ретровируса выполняют макрофаги [8].

В большинстве исследований зараженные мыши умирали спустя 4−6 недель после инфекции, обычно из-за разрыва чрезвычайно увеличенной селезенки. Вирус лейкемии Раушера вызывает иммунодепрессию в организме восприимчивых мышей с ослаблением стимуляции Т-лимфоцитов [9−11] с помощью механизмов, сходных с механизмами вирусов кори, вируса иммунодефицита человека и цитомегаловируса [12].

В вопросах эффективной противолейкозной терапии остается много не изученного. В публикациях появляются сообщения об изучении воздействий препаратов разных групп для терапии опухолей, в том числе лейкозов. В. М. Бергольц, Н. С. Кисляк, В. С. Еремеев [13] изучили и разработали оптимальный вариант лечения лейкоза Раушера в эксперименте на мышах с применением разных комбинаций ЦФ и ПАФ. ЦФ-циклофосфамид, алкилирующее средство, которое оказывает противоопухолевое, цитостатическое, иммунодепрессивное действие. ПАФ — адъювант Фрейда полный — масляная эмульсия, содержащая жирные кислоты и вакцину БЦЖ или липополисахариды микобактерий туберкулеза.

В настоящее время в результате внутрипородного скрещивания выведено много пород и линий мышей, характеризующихся высокой или, наоборот, низкой заболеваемостью спонтанным лейкозом. С учетом этого некоторыми исследователями предпринимались попытки экспериментального воспроизведения лейкоза с последующим применением средств стабилизации или лечения патологического процесса.

Цель исследований — изучить особенности иммунного ответа у мышей, зараженных RLV, на одномоментное введение вируса лейкоза Раушера с мононуклеарными стволовыми клетками, оценить переносимость и воздействие пробиотика субалина и препарата серебра сильверола.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ иммунологический зараженный мышь лейкоз Работа выполнялась в 2009;2011 гг. в лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии ФГУ ННИИПК Росмедтехнологий (зав. лаб. д-р мед. наук, проф. П. М. Ларионов); часть исследований (оценка функциональной активности лимфоидных клеток in vitro при тестировании спонтанной, Ти В-митоген-индуцированной пролиферации клеток селезёнки) была проведена на базе Научно-исследовательского института клинической иммунологии (д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник О. П. Колесникова).

Работа проводилась на 8 группах животных по 12 голов в каждой. Схема постановки включала использование антигена (АГ), стволовых клеток (СК), субалина, сильверола, АГ+СК, АГ+субалин, АГ+ сильверол интактных животных (контроль). Для оценки функциональной активности лимфоидных клеток изучали влияние антигенов на спонтанную и стимулированную митогенами пролиферацию спленоцитов. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н³— тимидина в ДНК делящихся клеток. Результаты оценивали в имп/мин. на 100×10³ клеток, подсчитывали средние значения по триплету. Оценку данных проводили в абсолютных значениях.

Методом микроскопирования в крови определяли абсолютное количество лейкоцитов и эритроцитов с последующим выведением лейкоцитарной формулы. Были выведены кривые летальности мышей. Наблюдение за мышами проводили в течение 11 мес.

Статистическую обработку полученных данных проводили методом подсчета средних арифметических (М), стандартных ошибок (m). В таблицах информация представлена в виде M ± m. Уровень значимости различий вариационных рядов оценивали параметрическим tкритерием Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Рис. 1. Кривая летальности мышей групп «Сильверол», «АГ+сильверол»

Рис. 2. Кривая летальности мышей групп «Субалин», «АГ+субалин»

Рис 3. Кривая летальности мышей групп «АГ», интактные (контроль), «СК», «АГ+СК»

Была экспериментально воспроизведена хроническая форма лейкоза Раушера мышей. Путем пальпаторного метода исследования определяли размеры селезенки (2 раза в неделю). В группе «АГ «увеличение селезенки у животных произошло на 4-й неделе после заражения. Такие же изменения были зарегистрированы у мышей в группе «АГ+ субалин». Животные, которым вводили сильверол, погибли в течение первых двух суток с явлениями перитонита. Животные, зараженные вирусом, гибли постепенно в течение 11 мес, начиная с 25-го дня после заражения. К этому сроку наблюдения (11 мес), летальность этой группы составила 100%. В группе «АГ+СК» первое животное погибло через 3 мес после заражения, другие в последующем в течение 9 мес. В группе «СК» выживаемость животных составила 100%. В группе «Субалин» в течение 2,5 мес погибло 58,3% животных. Примерно такая же летальность наблюдалась в группе «АГ+ субалин» за этот же период времени. В дальнейшем оставшиеся 5 животных (41,7%) из группы «Субалин», сохраняли стабильно удовлетворительное состояние на протяжении всего времени наблюдения.

Таким образом, мы наблюдали гибель животных, которым вводили сильверол, хроническое развитие лейкоза Раушера у животных, которым вводили вирус, и некоторую задержку гибели у мышей, которым вместе с вирусом Раушера вводили стволовые клетки.

Результаты гематологического исследования экспериментальных животных методом световой микроскопии представлены в табл. 1.

Таблица 1 Средние показатели лейкоцитарной формулы в мазках крови мышей BALB/c (расчет в% от 100 клеток).

* Р>0,95; ** Р> 0,99; *** Р> 0,999.

Через 7 мес после заражения наблюдали появление базофильных клеток у животных всех экспериментальных групп (кроме группы «СК»). В контрольной группе здоровых животных наблюдали достоверное увеличение палочкоядерных нейтрофилов и уменьшение моноцитов более чем в 3 раза. В группе «АГ» также регистрировали достоверное снижение в 4 раза моноцитов и появление юных клеток.

Наибольшие достоверные изменения произошли в группе «СК». Здесь имело место уменьшение количества эозинофилов в 4,4 раза, лимфоцитов — в 1,8, а также увеличение палочкоядерныхи сегментоядерных нейтрофилов в 1,5 и 2,5 раза соответственно. В группе «АГ+СК», кроме появления базофильных клеток, достоверных изменений не наблюдалось. Тестирование базофилов в крови инфицированных животных может подтверждать развитие миелоидного лейкоза. Относительная монопения и нейтрофилез с появлением юных клеток в группе «АГ» также свидетельствуют о развитии лейкемии.

Разница достоверна в сопоставлении с данными одной и той же группы в разные периоды времени (2 и 7 мес эксперимента).

Количественные изменения при гематологическом исследовании показали развитие анемии в группе «АГ»: эритроцитов 3,7± 1,3×10⁶ в 1 мкл крови (в группе интактных животных 8,5±3,3×10⁶) и увеличение абсолютного числа лейкоцитов в группе «АГ+СК»: 16,9±9,0×10³ в 1 мкл крови (в группе интактных мышей 7,7±2,9×10³).

Влияние антигена и стволовых клеток на спонтанную и стимулированную пролиферацию спленоцитов отражено в табл. 2.

Таблица 2 Уровень спонтанной и стимулированной митогенами пролиферации спленоцитов у мышей экспериментальных и контрольной групп, имп/мин.

Из представленных данных видно, что у инфицированных вирусом Раушера мышей снижается митоген-стимулированная пролиферация (30 667/1998 имп/мин на 6 мес и 53 681/21287 имп/ мин на 9 мес), что является одним из характерных признаков развития иммуносупрессии.

Введение

стволовых клеток на 6-м месяце опыта не стимулирует уровень пролиферативной активности (ConA соответственно: здоровые / АГ/ АГ + СК = 30 667 /1998 /1209 имп/мин). Однако на 7-м месце наблюдения спонтанная пролиферация в группе «АГ+СК» возрастала в 1,3 раза (АГ/ АГ+СК= 3883/5091 имп/мин), при увеличении ConA пролиферации в группе «АГ+СК» в 3,3 раза (АГ/АГ+СК=1016/3347 имп/мин).

Представленные результаты свидетельствуют об активизации инфекционного вирусного процесса, предопределяющего в последующем развитие лейкоза, однако требуют повторных, дополнительных исследований по изучению воздействия стволовых клеток на пролиферацию спленоцитов у мышей.

ВЫВОДЫ

У инфицированных мышей наблюдалось развитие лейкоза, сопровождающееся появлением базофильных клеток, в группе «АГ», снижение моноцитов в 4 раза и появление юных клеток. В группе «СК» уменьшилось количество эозинофилов в 4,4, лимфоцитов в 1,8 4. Установлено, что сильверол при введении его внутрибрюшинно мышам в дозе 0,5 мл обладает токсическим эффектом, вызывая 100%-ю гибель животных в течение 48 ч. Причина этого эффекта не установлена Количественные гематологические изменения показали развитие анемии в группе «АГ» и лейкоцитоз в группе «АГ+СК».

5. Выявлено, что переносимость субалина при однократном внутрибрюшинном введении мышам в количестве 1,5 дозы удовлетворительная, а введение стволовых клеток одномоментно с антигеном снижает летальность мышей.

Митоген-стимулированная пролиферация спленоцитов у инфицированных мышей снизилась (иммуносупрессия), и введение стволовых клеток не стимулировало уровень пролиферативной активности.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

• 1. Симонян Г. А., Хисамутдинов Ф. Ф. Ветеринарная гематология.- М.: Колос, 1995. 223 с.
• 2. John M. Forger, III and Jan Cerny. Thymic Hormone Modulation of Leukemogenic Virus Replication/ John M. Forger, III and Jan Cerny //Cancer Research.- 1976. № 36. Р. 2048;2052.
• 3. Leonardi GP. Sustained hypertransfusion and induction of a transplantable myeloid leukemia in RLV-Ainfected BALB/c mice/Leonardi GP, Lobue J, Manthos M, Orlic D, Mitra J// Ann N Y Acad Sci.- 1989.554. P. 88−115.
• 4. Varet B. Genetic control of antinuclear antibodies in mice infected with Rauscher leukemia virus/Varet B, Cannat A, Gisselbrecht S//Cancer Res.- 1977? Apr; 37 (4).- P. 1115−8.
• 5. Morse B Erythrokinetics and ferrokinetics of a viral-induced murine erythroblastosis/Morse B, Giuliani D, Fredrickson T, LoBue J.// Blood.- 1978. Apr, 51 (4).- P. 623−32.
• 6. N.J. de Both/ The effect of Rauscher murine leukemia virus infection on the hemopoietic system of BALB/c mice. Cell proliferation and cell loss/ de Both NJ, Vermey M, van Griensven LJ. // Exp Hematol.- 1978, Jun;6 (6).- P. 515−27.
• 7. Gamba-Vitalo C. Thrombocytopenia in a retrovirally-induced murine erythroleukemia / Gamba-Vitalo C., Lobue J, Fredrickson TN, Ien Sm, Pedersen J, Gordon AS, Pincus mR // Ann Clin Lab Sci. 1992 NovDec;22 (6):385−97.
• 8. Sydow G. The influence of macrophages on the leukemogenic activity of Rauscher murine leukemia virus/ Sydow G, Sydow H.// Arch Geschwulstforsch.- 1990. 60 (4).- 279−82.
• 9. Gabrilovich D. Effects of murine leukemia viruses on the function of dendritic cells / Gabrilovich D., Roberts M. S., Harvey J. J. et al. // Eur. J. Immunol.- 1993. 23. P. 2932−2938.
• 10. Gabrilovich D. I. Mechanism of Dendritic Cell Dysfunction in Retroviral Infection of Mice/ Gabrilovich D. I., Patterson S., Timofeev A. V., Harvey J. J., and Knight S. C.// Clinical Immunology and Immunopatology.- 1996. Vol. 80, No 2. P. 139−146.
• 11. Gabrilovich D. I. Murine retrovirus induces defects in the function of dendritic cells at early stages of infection/ Gabrilovich D. I., Patterson S., Harvey J. J., Woods G. M., Elsley W. and Knight C.//Cell. Immunol.- 1994. № 158. Р. 167−181.
• 12. Naniche D. Generalized immunosuppression: how viruses undermine the immune response/ Naniche D. and Oldstone M.// CMLS, Cell. Mol. Life Sci.-2000. 57. P. 1399−1407.
• 13. Бергольц В. М., Кисляк Н. С., Еремеев В. С. Иммунология и иммунотерапия лейкоза.- М.: Медицина, 1978. 404 с.