Сохранение активности заквасок в лабораторных условиях

Методы сохранения молочнокислых культур основаны на снижении скорости обмена веществ организмами и отделении клеток от продуктов их обмена. Обмен веществ микроорганизмов подавляется при снижении температуры или удалении влаги. При использовании этих методов для улучшения сохранения культур добавляют лактозу, сухое молоко и пр. Неблагоприятное действие кислоты снижают, добавляя буфер, например мел, и другие соединения. Клетки от продуктов обмена отделяют центрифугированием и в дальнейшем их помещают в питательную среду, содержащую защитные вещества. Практически методы, основанные на этих двух принципах, комбинируют. Например, после выращивания клетки отделяют от культуральной среды, распределяют их в новой среде и затем высушивают. В настоящее время чистые культуры и закваски молочнокислых бактерий сохраняют в жидком, высушенном и замороженном состоянии.

Жидкие культуры и закваски. Одним из наиболее старых способов сохранения чистых культур молочнокислых бактерий является поддержание их жизнеспособности путем периодических пересевов в стерильном молоке или других питательных средах. После внесения культуры в молоко (в пробирках) его выдерживают при температуре, оптимальной для развития данного вида микроорганизмов, и по окончании свертывания молока сохраняют до следующей перевивки. Частота пересевов зависит главным образом от температуры, при которой хранят культуры между пересевами. Если культуры после свертывания молока хранят при комнатной температуре, пересевать их в свежее молоко нужно не реже, чем через 5−7 дней (С.А. Королев, 1932, А. М. Скородумова, 1963). Если культуры хранят в холодильнике при 3−4° С, то их можно пересевать значительно реже: культуры мезофильных молочнокислых стрептококков и молочнокислых палочек — через 15−20 дней, термофильных стрептококков — через 20−30 дней.

Как правило, в процессе хранения в результате отмирания части клеток активность заквасок снижается, поэтому для восстановления первоначальной активности культур перед употреблением рекомендуется пересевать их в свежее молоко.

Для сохранения активности культур большое значение имеет своевременное прекращение жизнедеятельности микроорганизмов после сквашивания молока. Если культуры сразу после свертывания молока поместить в холодильник, то их первоначальная активность сохраняется, по крайней мере, в течение 8 дней. В то же время культуры, которые выдерживали в термостате после образования сгустка для дальнейшего созревания, часто оказывались неактивными уже через 3−4 дня хранения при 4−5° С (Е.М. Фостер, 1962). Некоторые авторы рекомендуют направлять культуры на холодильное хранение до образования сгустка (Б. Рийтер и А. Моллер-Мадсен, 1963). Добавляя к молоку мел, иногда можно сохранить культуры до 3−5 месяцев. X.Ц. Ольсену (1959) удалось сохранять удовлетворительную активность молочнокислых бактерий при 7,5−10° С в течение 8 месяцев в молоке, содержавшем 20% глицерина, 3% поваренной соли и 30% сахарозы.

Чтобы снизить влияние качества и состава молока на молочнокислые бактерии и предотвратить изменение их свойств, за границей (США и пр.) используют среды более постоянного состава: молоко, восстановленное из сухого обезжиренного или цельного молока одной проверенной партии или молоко от коров одной фермы. Сборное молоко считается лучшим, чем молоко от одного животного, так как средний химический состав его более постоянный. Однако даже в средах с постоянным составом желательно максимальное сокращение числа пересадок культур для сохранения их первоначальных свойств.

Культуры и закваски в высушенном состоянии. Культуры молочнокислых бактерий сушат сублимацией, закваски смешиванием с крахмалом, методами распыления и сублимации (лиофлизации).

Метод смешивания с крахмалом. Сущность метода заключается в высушивании заквасок путем смешивания с предварительно высушенным крахмалом. В дальнейшем он был усовершенствован предложено высушивать закваски, смешанные с крахмалом, в вытяжном сушильном шкафу током нагретого воздуха при температуре не выше 40° С. В процессе сушки заквасок этим методом погибает значительная часть микрофлоры и изменяются свойства микроорганизмов, входящих в состав закваски.

Метод распыления. Сущность его состоит в том, что в стерильное обезжиренное молоко с повышенным (до 16%) содержанием сухих веществ (перед стерилизацией в него добавляют сухое обезжиренное молоко) вносят 1% закваски молочнокислых бактерий. Заквашенное молоко выдерживают при температуре, оптимальной для развития данных микроорганизмов, и нейтрализуют 10% -ным раствором едкого натра до кислотности исходного стерильного молока. Нейтрализованную закваску высушивают на распылительной сушилке при температуре поступающего воздуха не выше 130° С и в зоне распыления — не выше 50° С. Сухие культуры смешивают с сухим стерильным крахмалом в пропорции 1:

1. Закваска, полученная этим методом, при влажности не выше 4−5% может сохранять достаточно высокую активность 3 мес. и более.

Метод получения сухих заквасок из бактериального концентрата. По этому методу микроорганизмы закваски выращивают в жидкой питательной среде, основа которой состоит из сыворотки и гидролизованного молока. Для стимуляции роста молочнокислых стрептококков рекомендуется применять трехзамещенный лимоннокислый натрий и сернокислый марганец, а для стимуляции роста молочнокислых палочек — дрожжевой автолизах и смесь буферных солей.

После выращивания на этой среде клетки бактерий отделяют от культуральной жидкости центрифугированием. Полученную биомассу разводят в стерильном обезжиренном молоке, содержащем 16% сухих веществ, и высушивают на распылительной сушилке. В сухой закваске, приготовленной этим методом, после хранения на холоде в течение 6 месяцев содержатся миллиарды клеток в 1 г. При высушивании бактериального концентрата путем смешивания с крахмалом методом распыления, где часть операций производится открыто, невозможно получить абсолютно чистую культуру. Кроме того, при высушивании закваски, состоящей из разных штаммов микроорганизмов, последние по-разному реагируют на неблагоприятные условия сушки. В результате этого трудно сохранять нужные соотношения между отдельными компонентами микрофлоры. Метод сублимации. Сущность метода состоит в высушивании бактериальных клеток, находящихся в замороженном состоянии, при высоком вакууме.

В последние годы проведена работа по подбору оптимальных условий приготовления заквасок, высушенных сублимацией из бактериального концентрата. Полученный концентрат, смешанный с защитной средой, фасуют во флаконы и высушивают при строго определенных режимах, после чего флаконы укупоривают. Подобраны условия выращивания и сушки заквасок разного видового состава микрофлоры. Выявлены основные факторы, влияющие на жизнеспособность заквасок, высушенных методом сублимации: состав среды и условия накопления клеток, способ их отделения, состав защитной среды, температура и длительность высушивания, конечная влажность (И.В. Лагода, Л. А. Банникова, 1970). Разработан метод прогноза стойкости сухой закваски путем прогрева ее сразу после выработки при 80° С в течение 30 мин. Установлено, что, если в закваске после термостатирования остается 27−38% живых клеток, она будет стойкой при хранении в течение 4−5 мес.

Исследования показали, что закваски, высушенные сублимацией, содержат 3−5 млрд. клеток в порции (0,1 г.). Применение их позволяет получать абсолютно чистую в микробиологическом отношении закваску при оживлении ее в стерилизованном молоке. В процессе хранения на холоду она полностью сохраняет свою жизнеспособность и соотношение компонентов микрофлоры в течение 4−5 мес.

Этим методом сушат также коллекционные культуры, которые можно использовать в течение ряда лет. По данным разных исследователей, выживаемость клеток составляет 40−80%, а иногда и 90% (в зависимости от индивидуальных свойств культуры и условий высушивания). Высушенные штаммы следует хранить при температуре не выше 10° С.

Культуры и закваски в замороженном состоянии. С целью полного прекращения жизнедеятельности микроорганизмов, максимального сокращения числа пересадок культур при хранении применяют быстрое замораживание их при низких температурах (-18-г—25°С). В замороженных культурах удается получать от 75 до 90% живых клеток от первоначального количества (Э.М. Фостер и др., 1962). Эти колебания зависят прежде всего от условий замораживания, а также от возраста культур, подвергавшихся замораживанию, и рН среды. Максимальную активность культур после дефростации удавалось получить, если их замораживали в логарифмической или в начале стационарной фазы роста. Нейтрализация культуры перед замораживанием или отделение клеток от культуральной среды с последующим внесением их в молоко с рН 7 также позволяет повысить активность замороженных культур.

Коллекционные культуры можно сохранять длительное время без перевивок в замороженном состоянии при температуре — 25 °C. По данным Л. А. Банниковой (19 536), ароматообразующие молочнокислые стрептококки в течение 6 мес. выдержки при — 25° С сохраняли свои свойства — способность к кислотообразованию, накоплению летучих кислот, ацетоина, диацетила. После размораживания культуры несколько дольше свертывали молоко, но полностью восстанавливали активность уже после первой пересадки в молоко, ацидофильные культуры сохраняют антибиотическую активность в течение длительного времени при — 25° С с пересевами и последующим замораживанием через б мес. Имеются сообщения о возможности сохранения замороженных при — 30° С культур в достаточно жизнеспособном состоянии в течение ряда лет (Э.М. Фостер, 1962; Е. Воле, Дж. Моко, 1967 и др.). За последние годы в разных странах проведены исследования по получению бактериальных концентратов, замороженных в жидком азоте В таких концентратах обычно хорошо сохраняется микробиологический состав заквасок. Они предназначены не для длительного хранения, а для непосредственного использования в производстве.