Материалы и методы исследования

При проведении исследования в качестве субстрата использовались пшеничные отруби, которые в нативном состоянии подвергали различным видам обработки: экструзионная, ультразвуковая и сверхвысокие частоты. Непосредственно перед проведением эксперимента исследуемые образцы измельчали с помощью лабораторной мельницы (d=1мм).

В качестве объектов исследования применялись микроорганизмы (бактерии) рубцовой жидкости молодняка крупного рогатого скота и модельный микроорганизм — Escherichia coli K12 TG1 с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi 54D10, выпускаемый «НВО Иммунотех» как биосенсор Эколюм-11.

Пробы рубцовой жидкости отбирали у фистульного бычка через 3 часа после кормления (пик рубцового пищеварения), которые затем фильтровали через 4 слоя стерильной марли. При работе с рубцовой жидкостью последнюю центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, при этом в эксперименте использовался супернатант, содержащий только бактерии.

Согласно инструкции биосенсор восстанавливали из лиофилизированного состояния охлажденной дистиллированной водой и выдерживали в течение 0,5 ч при 4 ^oС для реактивации биолюминесценции. Для эксперимента использовалась взвесь суточной культуры E. coli K12 TG1 в LB-бульоне. Биомассу стандартизировали по оптической плотности при 540 нм на спектрофотометре «СФ-46» до значений 0,5.

На первом этапе работы был проведен количественный учет адгезированных на кормовых частицах микроорганизмов рубцовой жидкости с помощью люминесцентной микроскопии, используя ранее разработанную нами методику [3]. Далее были проведены исследования, направленные на разработку метода количественного учета микроорганизмов, адгезированных к частицам растительных субстратов, с использованием биолюминометра.

При регистрации биолюминесценции использовался микропланшетный люминометр LM-01T c термостатом, разработанный в Институте биофизики СО РАН совместно со специальным конструкторским технологическим бюро «Наука» (г. Красноярск).

В процессе разработки способа количественного учета адгезированных микроорганизмов к частицам трофических субстратов с помощью микропланшетного люминометра для получения взвеси частиц одного размера проводилась их отмывка физиологическим раствором при режиме 1500 об/мин. Для инкубации использовалась взвесь суточной культуры E. coli K12 TG1 в LB-бульоне (0,5 оптической плотности). Взвесь биосенсора смешивали с полученным осадком частиц субстрата в соотношении 1:10. Полученную смесь выдерживали при +38°С в течение 30 мин в условиях периодического перемешивания.

Затем проводили центрифугирование опытной смеси при 1500 об/мин для разделения адгезированных и неадгезированных микроорганизмов. В осадке получили частицы со связавшимися микроорганизмами, а в супернантанте — неадгезированные бактерии. Супернатант раскапывали по 250 мкл в лунки планшета, который помещали в биолюминометр для измерения светимости бактерий в супернатанте в течение 20 мин. В качестве контроля использовалась взвесь модельного микроорганизма без внесения субстрата, которая также подвергалась инкубированию.

Полученные данные выражали в виде биолюминесцентного индекса (БЛИ) в %, который рассчитывается по формуле:

БЛИ = (1 — (К₁· О₂)/ (К₂· О₂))·100%,.

где БЛИ — биолюминесцентный индекс в %; К₁ — интенсивность свечения микроорганизмов в контрольном образце в начале опыта; К₂ — интенсивность свечения микроорганизмов в контрольном образце в конце экспозиции; О₁ — интенсивность свечения микроорганизмов в опытном образце в начале опыта; О₂ — интенсивность свечения микроорганизмов в опытном образце в конце экспозиции.

Полученные результаты были статистически обработаны с применением общепринятых методик при помощи пакета статистического анализа «STATISTICA 6».