Изучение параметров культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов

Изучение параметров культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов

Одной из причин высокой устойчивости нефти в окружающей среде является их ограниченная растворимость в водных средах, поэтому такие соединения малодоступны для микроорганизмов и с трудом подвергаются биодеградации.

При изучение оптимальной параметры культивирования активных углеводоро-докисляющих микроорганизмов. Выявлено, что нефтеокисляющие микроорганизмы показали хороший рост при диапазоне рН среды 7.0−9.0, так же определяли оптимальный рост углеводородокисляющих микроорганизмов, установлено оптимальной температуре +30єС. Все исследуемые активные углеводородокисляющие микроорганизмы обладают высокой эмульгирующей активностью и устойчивы высоким концентрациям поваренной соли.

В Казахстане продолжается интенсивное освоение ресурсов углеводородного сырья. Наряду с добычей и транспортировкой нефти и газа отмечается тенденция усовершенствования и дальнейшего развития нефтехимической промышленности. Центром развития нефтяной и нефтехимической отрасли стал Западный Казахстан. Масштабные разработки и добыча углеводородного сырья ведутся в Актюбинской, Атырауской, Западно-Казахстанской, Мангыстауской и Кзылординской [1].

На современном уровне развития нефтегазового комплекса не представляется возможным полностью исключить его негативное воздействие на окружающую среду. Проблема очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей, а иногда и экологического вреда применения для этих целей механических и физико-химических способов очистки. Наиболее перспективными в настоящее время являются методы биологической очистки экосистем при помощи микроорганизмов, использующих органические загрязнители в качестве источника углерода, при этом токсичные нефтепродукты трансформируются до углекислого газа и воды [2, 3, 4].

Для предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности вопросы охраны окружающей среды становятся все более актуальными. Возросшая экологическая опасность данных предприятий связана с выбросами в окружающую среду вредных веществ, появлением новых, зачастую трудноразлагаемых отходов и несовершенными природоохранными мероприятиями [5].

В связи с разнообразием почвенно-климатических условий, физико-химических свойств нефти и нефтепродуктов, уровня и срока действия загрязнения и стоимости мероприятий по рекультивации проблема поиска оптимальных и адаптированных к конкретным условиям методов остаётся весьма актуальной. Так, на территории Западного-Казахстана и других стран существует немало почв, в том числе и нефтезагрязнённых, с повышенной кислотностью и высокой засоленностью почва которая обусловлена естественными или антропогенными факторами. Климат Западного — Казахстана относится к резко континентальным, с жарким сухим летом и холодной малоснежной зимой, со значительными амплитудами сезонных и суточных температур. Для него характерна большая сухость воздуха. Осадков выпадает менее 200 мм в год. Примитивные приморские почвы не имеют развитого гумусового горизонта. Эти почвы не пригодны для сельскохозяйственного освоения, могут быть лишь использованы для выпаса сельскохозяйственных животных. Почвенный покров представлен в основном бурыми, солонцеватыми и песчаными типами почв, для которых даже слабое загрязнение углеводородами приводит к нарушению равновесия в почвенной экосистеме [6].

В этой связи особую актуальность приобретают исследования направленные на выделение и отбор наиболее активных углеводородокисляющих микроорганизмов, способных трансформировать и утилизировать нефтяные углеводороды. Имеется ряд российских и зарубежных препаратов, разработанных на основе микроорганизмов, предназначенных для ремедиации нефтезагрязненных территорий. Несмотря на это поиск местных аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов на территории Казахстана, где происходит основная добыча нефти актуален, это связано, в первую очередь, с высокой степенью аридности климата и особенностями пустынных почв.

Целью исследование — изучить оптимальные параметры культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов.

С целью проведения научно-исследовательских работ использовали следующие материалы:

Микроорганизмы: Выделенные углеводородокисляющие микроорганизмы из нефте-загрязненных почв Западного Казахстана.

Питательные среды: сухой питательный бульон и агар (СПБ, СПА)).

Определение оптимального диапазона кислотности и солености среды для исследуемых культур микроорганизмов проводили на среде СПБ (рН от 3 до 9, NaCl от 3% до 10%). Уровень рН среды устанавливали путем добавлением HCl или 3% KOH.

Для определения оптимальной температуры культивирования, микроорганизмы выращивали при температурах от 20 до 40 0С. Наличие роста отмечали визуально по 4- бальной шкале.

Определение эмульгирующей активности. Эмульгирующую активность определяли визуально согласно методике [7] по четырёхбалльной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта, полученного после центрифугирования культуры, выращенной на среде с вазелиновым маслом, согласно методике в нашей модификации. Пробу культуры объёмом 1 мл, выращенной на среде В-Д с вазелиновым маслом в течение 48 ч., центрифугировали в течение 3 мин при 10 000 g на микроцентрифуге «Eppendorf 5415» (Германия, 2005). Супернатант (1 мл) переносили в пробирки, добавляли 1 мл среды В-Д и 0,5 мл вазелинового масла. Содержимое пробирки перемешивали на миксере в течение 2 мин. В качестве контроля использовали 0,5 мл вазелинового масла в 2 мл среды В-Д. Оценка поверхностной активности проводилась по оптической плотности исследуемых образцов на КФК-2 при длине волны 540 нм [8].

Одним из основных факторов, влияющих на скорость биодеградации нефти, является температура и рН среды. Температура влияет на нарушение нефти, воздействуя на физическую природу и химический состав нефти, на скорость метаболизма углеводородов микроорганизмами и состав микробного сообщества [9]. При низких температурах возрастает вязкость нефти, снижается испарение токсичных соединений, уменьшаются темпы биодеградации. Считается, что для развития нефтеокисляющих бактерий и интенсификации процесса очистки воды и почвы от нефти оптимальными являются мезофильные условия +20−30єC. При температуре +6−15єC интенсивность трансформации нефти снижается в 2,5−4 раза, при +40єC рост бактерий ограничивается и процесс замедляется [10].

У отобранных культур микроорганизмов изучали способность их роста в присутствии различных концентраций хлорида натрия, кислотности среды и температуры, в качестве единственного источника углерода и энергии использовали нафталин.

Результаты по визуальной рост культур микроорганизмов при разных значениях pH приведены в таблице 1.

Для оценки роста нефтеокисляющих микроорганизмов в зависимости от различных диапазонов рН среды, использовали питательную среду СПБ с добавлением дизельного топлива.

Из табличных данных видно, что культуры микроорганизмов при разных значениях pH показало, что наиболее благоприятной средой для репродукции микроорганизмов является диапазон значении pH среды от 5 до 9,0, кроме культур Т2, U2.4 U2.6 при значение pH показал отсутствия роста.

Сильнокислая среда (pH 3) не благоприятна для роста углеводородокисляющих микроорганизмов. Одной из причин высокой устойчивости нефти в окружающей среде является их ограниченная растворимость в водных средах, поэтому такие соединения малодоступны для микроорганизмов и с трудом подвергаются биодеградации.

Для определения оптимального роста микроорганизмов необходима соответствующая его видовым потребностям температура. С этой целью нами изучен рост отобранных микроорганизмов при разных температурных режимах. Результаты опыта представлены в таблице 2.

Изучение влияния температуры на накопление культур микроорганизмов показало, что, при температурах от 20 до 35 °C все изоляты дали интенсивный рост микроорганизмов. Тогда как, при 40 °C только у изолятов Т2 и ЖН2 наблюдали отсутствие роста. Следовательно, можно отнести всех выделенных культур мезофильным видам бактрий.

На эффективность биоочистки нефтезагрязненной почвы в значительной степени влияет уровень содержания в почве минеральных солей и степень загрязнения нефтью. По данным литературы [11], почва Западной — Казахстанской области сильнозасоленная — более 4%. Высокое содержание солей подавляет жизнедеятельность многих микроорганизмов.

В следующей серии опытов была проведена визуальная оценка роста выделенных культур при различных концентрациях поваренной соли от 3% до 9%. Все исследованные культуры микроорганизмов хорошо росли на среде СПА, содержащей 3% и 5% поваренной соли. На среде с содержанием высокой концентрации поваренной соли (7%, 9%) все изоляты, кроме 14/2 культуры показали плохой рост (таблица 2). Результаты проведенных исследований представлено в таблице 3.

Помимо высокого засоления почвы на эффективность биоутилизации нефти УОМ оказывает влияние и способность УОМ продуцировать биоПАВ (биосурфактанты, биоэмульсины). Известно, что многие виды микроорганизмов способны продуцировать поверхностно-активные вещества, которые превращают углеводороды нефти в эмульсию, что способствуют лучшему усвоению их микроорганизмами [12]. Микроорганизмы, продуцирующие биосурфактанты, проявляют высокую поверхностную активность при росте на гидрофобных субстратах, таких как гексадекан, вазелиновое масло и т. д., поэтому для изучения эмульгирующей активности нами использовано вазелиновое масло.

Эмульгирующую активность выделенных изолятов определяли визуально по четырёхбалльной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта при длине волны 540 нм, полученного после центрифугирования культуры микроорганизмов, выращенной на среде с вазелиновым маслом. Результаты эмульгирующей активности углеводородокисляющих микроорганизмов представлены в таблице 4.

Изучение способности бактерий к синтезу естественных поверхностно-активных веществ (ПАВ, биосурфактантов, биоэмульгаторов), которые снижают поверхностное натяжение и способствуют повышению степени биодеградации, показало, что индекс эмульгирования с использованием вазелинового масло у всех используемых штаммов различен. При визуальной оценке обладали хорошей поверхностной активностью, по оптической плотности показало высокую оптическую плотность супернатанта — больше 0,1 ед., индекс эмульгирование, использованнных культур варировало в пределах 6,6%-60%. На основании полученных результатов изучаемые микроорганизмы продуцировали в определенной степени биоПАВ относящиеся к экзотипу (биосурфактанты экскретируются в культуральную жидкость).

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что углеводородокислющие микроорганизмы показали хороший рост при: диапазоне рН среды 7,0−9,0, оптимальной температуре +30 єС и устойчивы при концентрации поваренной соли от 5 до 9%. Все исследуемые изоляты эмульгировали вазелиновое масло, т. е. продуцировали биоПАВ.

биологический нефтезагрязненный почва бактерия.

• 1. Булатов А. И., Макаренко П. П., Шеметов В. Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. — М.: Недра, 1997. — 470 с.
• 2. Стабникова Е. В., Селезнева М. В., Рева О. Н., Иванов В. Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв // Прикладная биохимия и микробиология. — 1995. — № 5. — С. 534−539.
• 3. Коронелли Т. В., Комарова Т. И., Ильинский В. В. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология. — 1997. — № 2. — С. 198−201.
• 4. Белоусова Н. И., Шкидченко А. Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикладная биохимия и микробиология. — 2004. — № 3. — С. 312−316.
• 5. Кобзев Е. Н., Петрикевич С. Б., Шкидченко А. Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов — нефтедеструкторов в открытой системе // Прикладная биохимия и микробиология. — 2001. — Т. 37. — № 4. — С. 413−417.
• 6. Надиров Н. К. Нефть и газ Казахстана. — Алматы: ?алым, — Ч. 2 — С. 5−26.
• 7. Диаров М. Д. Экология и нефтегазовый комплекс. — Алматы: Галым, 2003. -Т. 2. — 832 с.
• 8. Лурье Ю. Ю., Рыбникова А. И. Химический анализ производственных сточных вод. — М.: Химия, 1974. — 290 с.
• 9. Francy D.S., Thomas J.M., Raymond R.L., Ward H. Emulsification of hydrocarbons by subsurface bacteria // J. of Industrial microbiology. — 1991. — Vol. 8. — P. 237−246.
• 10. Cirigliano M.C., Carman G.M. Isolation of bioemulsifier from Candida lipolitica // Appl. And Environ. Microbiol. — 1984. — P. 747−750.
• 11. Desai D., Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potencial // Microbiol. Molecular Biol. Rev. — 1997. — Vol. 61. — P. 47−64.
• 12. Burd, Ward O.P. Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates: the role of biocurfactants // Biotechnol. Tech. — 1996. — Vol. 10, № 5. — P. 371−374.