Методы исследования. 
Использование белковых маркеров для контроля качества гибридов кукурузы в Республике Беларусь

Лабораторные испытания семян кукурузы проводились Испытательной лабораторией качества семян УО БГСХА, соответствующей критериям системы аккредитации Республики Беларусь и международным требованиям по СТБ ИСО / МЭК 17 025−2007.

Проведение электрофоретического анализа запасного белка кукурузы — зеина, идентификацию и интерпретацию результатов полученных белковых спектров проводили согласно СТБ 1710−2006 «Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий» [2] .

Для получения модельных матриц исходных родительских линий использовали оригинальные образцы (эталонные электрофореграммы), предоставленные учреждениями-оригинаторами гибридов. В качестве материала для исследований использовались гибриды кукурузы (простые, двойные межлинейные, трехлинейные, простые модифицированные), родительские формы гибридов (простые гибридные комбинации, самоопыленные линии) различных регионов селекции, поступающие в Республику Беларусь.

Основная часть

урожайность кукуруза гибрид электрофоретический Нормативно-правовая база применения метода электрофоретического анализа для контроля качества семян кукурузы на территории Республики Беларусь в полной мере регламентирована с момента введения в действие в 2006 г. СТБ 1710−2006 «Семена кукурузы. Метод определения уровня гибридности семян первого поколения, оценка типичности и маркирование инбредных линий» [2].

Эффективность проводимых исследований и значимость принятия Государственных стандартов на применяемый метод контроля можно наглядно продемонстрировать полученными результатами за годы работы испытательной лаборатории.

Приведенные восьмилетние данные (рис.) по количеству партий гибридов кукурузы с показателями гибридности ниже значений, установленных в нормативных документах, позволяют оценить динамику и однонаправленное изменение показателя. Присутствует довольно четкая тенденция постоянного уменьшения количества партий гибридов с пониженным уровнем гибридности. Особенно это относится к трехлинейным гибридам, имеющим наибольший удельный вес в общем объеме используемых гибридов на территории республики.

Учитывая высокую результативность и объективность результатов электрофоретического анализа зеина, на основе имеющихся практических данных [6] и реальных генетических характеристик гибридов кукурузы Министерством сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь ранее были установлены требования по отношению к оплате закупаемых гибридных семян кукурузы согласно их качеству. Так, стоимость простых межлинейных гибридов оплачивалась в полном объеме только при условии, что уровень гибридности составлял не менее 95%; при гибридности от 94 до 90% цена пропорционально уменьшалась на 3% за каждый процент снижения гибридности. Для двойных межлинейных и трехлинейных гибридов, при показателях гибридности до 85% и выше, семена оплачивались в полном объеме стоимости, при гибридности 84−80% цена уменьшалась на 3% за каждый процент снижения гибридности. Семена с уровнем гибридности ниже 80% не допускались к использованию.

Начиная с 2011 г. ко всем закупаемым гибридам кукурузы установлен нижний порог уровня гибридности на уровне 95%, для отцовских родительских форм простых и трехлинейных гибридов — типичность не ниже 99%. В этой связи интересно проследить динамику изменчивости в уровне гибридности семян кукурузы зарубежной селекции (табл. 1).

Таблица 1. Средние показатели уровня гибридности кукурузы зарубежной селекции (%) по результатам испытаний 2004;2011 гг.

Примечание: пробы не анализировались Как свидетельствуют данные, на протяжении восьми лет изучения поступающих в Республику Беларусь гибридных форм кукурузы средние показатели гибридности находились на довольно высоком уровне. Более того, в последние 3−4 года прослеживается явная тенденция к увеличению величин показателей гибридности ввозимых в Республику Беларусь семян кукурузы.

Следует отметить, что визуальная идентификация гибридности на основе белковых спектров районированных на территории Беларуси гибридов имеет свои особенности, обусловленные различием в проявлении белковых маркеров гибридности (табл. 2). Прежде всего это относится к процедуре идентификации трехлинейных гибридов.

Таблица 2. Характер маркирования уровня гибридности гибридов кукурузы и их родительских компонентов

Условные обозначения: ТЛ — трехлинейный гибрид; ДМЛ — двойной межлинейный гибрид; ПГ — простой гибрид В результате практической работы установлено, что у 80% анализируемых трехлинейных гибридов отцовская форма имеет четко выраженные маркерные компоненты по сравнению с материнским простым гибридом, выявляемые в основном в зоне средней миграции молекулярных форм зеинового комплекса.

Основную проблему вызывают трехлинейные гибриды, не имеющие четкого отличительного маркера по отношению к материнской форме. В ряде случаев идентификация таких форм основывается на принципах поиска отличных компонентов отцовской формы по сравнению с каждой самоопыленной линией, составляющей материнский простой гибрид [2, 9].

Однако встречаются такие формы, для которых отцовская родительская форма не выявляет отличительных компонентов по сравнению с материнскими формами, в таком случае идентификацию маркеров гибридности проводят на основе дополнительных компонентов материнских форм. Анализу в данном случае подлежат не отличительные отцовское маркеры гибридности, а гомозиготы отличительных материнских компонентов, полученные от самоопыления или сестринского опыления.

Как свидетельствуют полученные данные, все из проанализированных гибридов кукурузы имеют зеиновые маркеры гибридности разной представленности. В то же время установлена специфика их распределения по родительским компонентам гибридов и типу гибрида.

Для большинства гибридов белковые маркеры гибридности обусловлены в основном отцовскими родительскими формами. Исключением является двойной межлинейный гибрид Адонис 224 СВ, оценка уровня гибридности которого возможна за счет белковых маркеров как отцовской, так и материнской форм.

Установлено, что по всем проанализированным гибридам количество маркерных белковых позиций преобладает в зоне средней миграции зеинового комплекса (электрофоретическая подвижность rf в пределах от 0,4 до 0,6).

В отношении гибрида Якуб установлено, что белковые маркеры гибридности могут быть идентифицированы только за счет материнской формы.

Проведенный анализ электрофоретических спектров зеина родительских форм выявил свои особенности в характере проявления маркеров гибридности.

Следует отметить, что хотя все анализируемые формы представляют собой простые гибриды, однако они выявляют неравнозначность в проявлении маркеров гибридности как по генотипу родителей, так и по зонам электрофоретического спектра. Особое внимание обращают на себя простые гибриды Сирена С, Кросс 220 С, по которым белковые маркеры гибридности определяются только по отцовской форме. По остальным формам отмечено увеличение общего количества зеиновых маркеров гибридности по зонам белкового спектра (зонам миграции).

В отношении родительских компонентов гибридов, кроме установленных белковых маркеров гибридности, нами был выявлен еще ряд дополнительных особенностей в отношении характеристик белкового спектра и генетической структуры. Это относиться к отцовским формам трехлинейных гибридов, представляющим собой самоопыленные линии.

Было установлено, что целый ряд таких форм характеризуется выраженной генетической разнородностью, представленной наличием нескольких типов (биотипов, белковых профилей), имеющих четкие белковые отличительные признаки.

Кроме того, они характеризуются достаточно широким диапазоном варьирования молекулярных форм зеинового комплекса в сравнении с биотипами самоопыленных линий между собой.

Особенно четко межбиотипные отличия по родительским формам наблюдаются в случаях, когда в их создании участвуют несколько сестринских линий с модификациями-заменами одной из сестринских форм. Такую же особенность проявляют и некоторые из проанализированных простых модифицированных гибридов (табл. 3).

Таблица 3. Характеристика белкового спектра зеина простого модифицированного гибрида

Известно, что модифицированные гибриды — это потомство первого поколения, полученное от скрещивания гибридной комбинации двух родственных линий (А Ч А₁) с самоопыленной линией (В), т. е. формула модифицированного гибрида выглядит следующим образом: [(А Ч А₁) Ч В].

Если исходить из этого определения, то уровень гибридности у модифицированных гибридов следует определять по формуле, используемой для оценки уровня гибридности простых гибридов:

(1).

где S — количество «гибридных» ЭФ спектров, шт.; N — количество анализируемых зерновок, шт. (равное 100 шт.).

Следует отметить, что использование данной формулы правомерно только в том случае, если предварительно было получено электрофоретическое доказательство идентичности зеиновых спектров сестринских линий (А и А₁) материнской формы модифицированного гибрида (на основе эталонных электрофоретических матриц, оригинальных семян сестринских линий).

Однако в процессе производства семян родительских форм интересуемого модифицированного гибрида семеноводы и сами селекционеры, стремясь увеличить урожайность материнской гибридной комбинации, вносят существенные модификации-замены одной из сестринских форм. В этом случае обязательна процедура проверки электрофоретических спектров исходных родительских линий материнской гибридной комбинации изучаемого модифицированного гибрида. Только в данном случае метод электрофореза зеина будет объективным арбитром качества работы и корректности в соблюдении исходной селекционной формулы данного простого модифицированного гибрида.

Если полученные электрофореграммы сестринских линий будут характеризоваться несколькими типами белковых профилей (белковых биотипов), это означает, что родительские линии материнской формы (А и А₁) не являются родственными и в этой новой комбинации, возникшей по самостоятельной инициативе создателей или производителей родительских форм, анализируемый простой модифицированный гибрид становится трехлинейным гибридом, уровень гибридности которого уже следует оценивать по другой формуле:

(2).

где М — количество ЭФ спектров обнаруженных гомозигот, шт.; N — общее количество анализируемых зерен, шт. (равное 200 шт.).

Основываясь на результатах нашей работы, можно констатировать, что анализ и идентификация результатов электрофореза по простым модифицированным гибридам в большинстве своем проводится с учетом того, что используемые материнские сестринские линии обладают идентичными характеристиками белковых спектров зеина. Поэтому уровень гибридности определяется в соответствии с критериями, применимыми к расчетам для простых гибридов.

Однако встречаются материнские формы модифицированных гибридов, включающие неидентичные по зеиновому комплексу сестринские линии, и оценка показателя гибридности в данном случае будет проводиться как для трехлинейного гибрида.

Таким образом, использование стандартизированного метода контроля качества семян кукурузы на основе белковых маркеров позволяет надежно контролировать параметры, определяемые нормативными документами на семенной материал, оценивать генетические особенности используемых форм кукурузы для формулирования корректных выводов о качестве.

Введение

стандартизированных методик в области контроля качества семян в условиях Республики Беларусь проводится для того, чтобы дать каждому производителю четкое понимание, какие требования к продукции и процессу производства он должен выполнить, а потребителю — уверенность в том, что он пользуется качественным продуктом.

Использование методик уровня государственных стандартов в области контроля качества семенной продукции при осуществлении международной торговли должно обязательно реализовываться по принципу: один стандарт, одно измерение, один и тот же подход.

Только в этом случае можно гарантировать сопоставимость и воспроизводимость конечного результата испытания семян (гибридность, типичность, сортовая чистота, сортовая идентификация и т. п.) в условиях профильных лабораторий различных государств. Реализация этого принципа должна происходить через гармонизацию, соответствие требований, совершенствование законодательства в области семенного и сортового контроля, гармонизацию стандартов, унификацию методик, взаимное признание результатов.