Симбиотическая фиксация азота

Взаимоотношение почвенных микроорганизмов и высших растений является одной из сложных проблем биологии, которая привлекает большое внимание многих исследователей. Особенно это касается процессов симбиотической и ассоциативной фиксации молекулярного азота из воздуха бобовыми и злаковыми растениями. Наибольший удельный вес в обеспечении растений биологическим азотом приходится на симбиотическую азотфиксацию.

Так исследования Г. С. Егорова, Н. А. Кириличева, Лемякина П. М. [70] показали, что за счет симбиотической азотфиксации люцерна оставляет в почве до 171,8 — 298,1 кг/га азота.

Исследованиями Б. П. Михайличенко [139] установлено, что бобовые травы за счет фиксации молекулярного азота из воздуха оставляют в почве с пожнивными остатками до 100 — 170 кг симбиотического азота.

По данным М. В. Федорова [216] клевер за год фиксирует азота из атмосферы до 143 кг/га. В свою очередь П. И. Шиян, В. К. Черепанов [237] считают, что растения клевера усваивают в год 277 — 372 кг/га атмосферного азота.

По данным ряда исследователей при строгом соблюдении технологии залужения и ухода за посевами бобовых трав, каждый гектар клевера лугового за счет азотфиксации накапливает в почве 120 — 150 кг азота, люцерны — 180 — 210 и эспарцета — 200 — 230 кг [76, 78].

Данные исследований В. П. Спасова, С. В. Грислиса и Н. И. Арзамасцева [193] показывают, что в содержании общего азота сухой массы клевера лугового большая доля приходится на азот симбиотический. В среднем за 2 года исследований (1998 — 1999 гг.) в урожае сухой массы клевера лугового накапливалось 86,0 — 120,5 кг/га симбиотического азота.

Химизм процесса азотфиксации еще полностью не раскрыт. Из существующих гипотез наиболее вероятной является гипотеза восстановительного связывания азота атмосферы с образованием в качестве первичного продукта гидроксиламина, который быстро превращается в аммиак. Восстановительная теория, предложенная С. Н. Виноградским, получила подтверждение в работах ряда исследователей [133, 161, 208]. После образования аммиака происходит процесс амминирования кетокислот (предположительно пировиноградной, щавелевоуксусной, кетоглутаровой) с образованием аминокислот.

Известно, что для фиксации атмосферного азота необходимо кооперированное взаимодействие растения — хозяина и бактерий, присутствующих в его корневых клубеньках. Растение обеспечивает бактерии питательными веществами, главным образом сахарами, и создает для них благоприятные условия. Микроорганизмам, фиксирующим молекулярный азот, приходится расходовать значительное количество «биологического топлива». Для клубеньковых бактерий, превращающихся в клубеньках бобовых растений в так называемые бактероиды, таким биологическим топливом являются продукты фотосинтеза, транспортируемые из листьев в корневую систему. Продукты фотосинтеза представлены в виде сахаров, органических кислот и образовавшихся из них в клубеньках запасных полисахаридов и жирных кислот, в процессе превращения которых ферментативными системами бактероидов образуются АТФ и восстановители, необходимые для проявления активности нитрогеназы [159].

Азот из клубеньков в бобовое растение поступает с разной интенсивностью в различные фазы роста растений. Наибольшее поступление азота из клубеньков наблюдается перед и в период цветения.

Интенсивность симбиотической азотфиксации зависит от вида и урожайности бобовых растений, условий их выращивания, фенологической фазы развития растений и ряда других факторов. Так, клевер в расчете на 1 га может фиксировать за вегетационный период до 150 — 160 кг молекулярного азота, люпин — 100 — 170, люцерна — 250 — 300, горох, вика и фасоль — 70 — 80 кг. Примерно треть связанного бобовыми азота остается в пожнивных остатках, и после минерализации может использоваться последующими культурами. В среднем в расчете на 1 т сена клевера в корневых и пожнивных остатках содержится и поступает в почву 10 — 15 кг/га азота, сена многолетних бобово-злаковых трав — 6 — 9, зеленой массы люпина — 1 — 1,5 кг/га азота [3]. Что касается фенологических фаз у бобовых культур, то исследованиями Е. Н. Бронь [29], Г. С. Посыпанова [170], Г. С. Посыпанова, Р. В. Боткова, Р. И. Чернова, Е. П. Трепачева [206] установлено, что наиболее интенсивно фиксация азота у клевера протекает в период бутонизации — цветения.

На интенсивность азотфиксации бобовыми культурами большое влияние оказывают также условия внешней среды: влажность, аэрация почвы и ее кислотность. Наиболее активная азотфиксация у клевера ползучего и лугового заметно проявляется при рН — 6,0. Лучше всего развиваются клубеньковые бактерии при рН 6,0 — 7,0. За пределами рН 3,5 и 11,5 рост их приостанавливается, и бобовые растения не фиксируют атмосферный азот [115, 168, 191].

Так, в опытах В. К. Шильниковой и И. М. Нестеровой [236] установлено, что в среде с низким значением рН нарушается структура поверхности корня, снижается количество инфекционных нитей и изменяется цитоморфологическая структура в них. Ими также выявлено, что при выращивании клевера лугового в среде с рН 4,8 в бактероидной зоне клубеньков наблюдается ранний и массовый лизис бактероидов и процесс отпочковывания от них мелких коковидных клеток, что приводит к ослаблению азотфиксирующей способности. По данным А. Э. Роосалу [183] под влиянием кислой почвы азотфиксирующая способность клевера ползучего снижалась на 8,9 — 44,8%.

Большое влияние на величину азотфиксации оказывают метеорологические и другие условия. Так, исследованиями Т. Ф. Персиковой [165] установлено, что величина фиксации атмосферного азота клевером зависит от метеорологических условий и фосфорно-калийного питания и колеблется (в среднем за 2 года исследований) от 169 до 203 кг/га, а коэффициент азотфиксации от 0,52 до 0,67.

Не меньшее влияние оказывает и влажность почвы. Так, понижение влажности почвы до 35% от максимальной влагоемкости почвы (60 — 70%) снижает азотфиксирующую способность клевера на кислой почве до 66,5 — 68,5%, на известкованной — до 55,8 — 91,2% и на карбонатной — до 63,2 — 65,2%. В травосмеси (клевер ползучий + мятлик луговой + овсяница луговая) известкование обусловило увеличение количества связанного азота до 53,4%. Пониженная влажность почвы вызвала уменьшение азотфиксирующей способности до 47,9 — 76,4% по сравнению с оптимальным режимом влажности. Данные ряда исследователей показывают, что оптимум влажности, при которой активно образуются клубеньки лежит в пределах 60 — 70% от полной влагоемкости. Недостаток влаги препятствует образованию клубеньков [103, 149]. Кроме того, клубеньковые бактерии являются аэробными микроорганизмами. Хорошая аэрация способствует развитию клубеньков на корнях бобовых растений и фиксации ими молекулярного азота.

Значительное влияние на развитие клубеньков оказывает температурный режим. Оптимальная температура для большинства клубеньковых бактерий около 24 — 26^оС, при температуре ниже 5^оС и выше 37^оС рост бактерий приостанавливается. По данным М. М. Гуковой [60], понижение температуры ниже оптимума менее подавляет азотфиксацию, чем равнозначное повышение температуры. При температуре ниже 10^оС образуются клубеньки, но усвоения азота не происходит.

Важнейшим фактором, влияющим на произрастание бобовых растений, развитие клубеньковых бактерий, а также фиксацию атмосферного азота, является обеспеченность почвы усвояемыми соединениями фосфора и калия. Так, по данным С. В. Грислиса и Н. И. Арзамасцева [59] для нормального развития клевера лугового содержание подвижного фосфора должно достигать 100 — 150 мг на кг почвы. Положительное влияние фосфорно-калийных удобрений на процесс биологической азотфиксации травостоев подтверждается результатами исследований других авторов [193, 203, 204]. Так, при подсеве клевера и внесении Р₆₀К₉₀ в 2000 г. увеличение фиксированного азота агроэкосистемой только за 2000 и 2001 гг. составило 349 кг/га по сравнению с контрольным вариантом. Данные исследований Н. Н. Кормякова с соавторами [102] также указывают на высокую эффективность фосфорно-калийных удобрений в повышении азотфиксации. Так, клевером в первый год жизни на фоне Р₆₀К₆₀ усвоено 54 кг/га азота, на фоне Р₁₂₀К₆₀ — 52 кг/га, что выше на 15 — 13 кг/га по сравнению с контролем.

Низкая обеспеченность почвы фосфором, калием и микроэлементами в условиях Республики Беларусь приводит к снижению азотфиксации клеверов со 170 до 70 кг/га. При невысоком их содержании в почве проникновение бактерий в корень происходит, но образование клубеньков при этом не наблюдается [136].

Что касается азота, то результаты учетов показывают заметное ингибирование всеми формами азотных удобрений образования клубеньков, начиная с дозы 60 кг/га. При дозе 480 кг/га у клевера они обнаруживались лишь у 6 — 31% [115, 137]. Некоторые исследователи утверждают, что снижение количества и массы клубеньков происходит даже при внесении небольших доз минерального азота [271]. В ряде случаев минеральный азот приводил к более позднему образованию клубеньков, отрицательно влиял на гемоглобин клубеньков, изменение активности нитрогеназы, способствовал ухудшению качества белка [88, 223, 250].

Исследованиями Z. Ambroz [246] установлено, что каждый килограмм минерального азота, внесенного на посевах люцерны снижает фиксацию азота на 0,5 кг.

По данным A. Anon [247] внесение N_100−150 на травостое с участием клевера ползучего приводило к его выпадению в течение 1 — 3 лет, что сильно влияло на общий сбор кормовых единиц и протеина. В опытах A. Duskmans [252] при внесении азотных удобрений доля клевера ползучего снизилась с 43 до 14%.

В исследованиях Н. А. Донских [67] увеличение нормы внесения азотных удобрений до 90 кг/га на бобово-злаковом травостое приводило к резкому снижению коэффициента его эффективности: при 3-укосном использовании до 21% а при 2-укосном — до 0%.

Г. Д. Харьков [218] утверждает, что для первоначального роста и перехода на питание симбиотическим азотом многолетним бобовым травам достаточно, что бы в почве было 15 — 20 кг/га минерального азота. Такое количество азота всегда имеется, что гарантирует оптимальные условия для первичного формирования фотосинтетического аппарата у бобовых растений, от работы которого зависит активный симбиоз с клубеньковыми бактериями. Однако ряд ученых указывает на необходимость внесения небольших стартовых доз азотных удобрений (20 — 40 кг/га) [82, 227].

Существенное влияние на симбиотическую фиксацию азота оказывают микроэлементы. Положительное влияние их на величину азотфиксации отмечают в своих работах Н. И. Мильто [136], А. И. Карбинович [93], Е. Н. Мишустин, В. К. Шильникова [148] и другие.

Наиболее изучена в этом отношении роль молибдена и бора. Положительное влияние молибдена на симбиотическую фиксацию атмосферного азота прежде всего объясняется тем, что он входит в состав фермента нитратредуктазы и является необходимым компонентом цепи редукции нитратов, участвуя в восстановлении нитратов до нитритов. Молибден можно назвать микроэлементом азотного обмена растений, так как он входит в состав нитрогеназы — фермента, осуществляющего в процессе биологической фиксации азота связывания азота атмосферы. Участие молибдена в фиксации молекулярного азота атмосферы объясняет его особое значение для роста и развития бобовых культур.

Потребность клубеньковых бактерий в микроэлементах сравнительно низка, но при их отсутствии азотфиксация сильно снижается. Она характеризуется следующими средними показателями (10^-3моль) Mg — 0,1, Ca — 0,025, Fe — 0,005 — 0,01, Mn — 0,0001 — 0,01, Zn — 0,0001 — 0,001, Co — 0,1. Помимо указанных элементов Rhizobium необходимы также фосфор, натрий, молибден, сера, бор, медь, биотин, тиамин, пантотеновая кислота [255].

Таким образом, создание оптимальных условий роста и развития бобовых растений и азотфиксирующих бактерий усиливают процесс фиксации атмосферного азота.

Бобовые растения используют атмосферный азот и дают высокие урожаи в том случае, когда у них складывается эффективный симбиоз с азотфиксирующими бактериями. Если почвы содержат мало клубеньковых бактерий или дикие формы малоэффективны, бобовое растение прекращает накапливать биологический азот и начинает потреблять почвенный. Такая закономерность наблюдается на полях, где никогда не произрастали бобовые растения или в почве обитают неактивные формы азотфиксирующих бактерий. В связи с этим в сельскохозяйственную практику вошел агротехнический прием инокуляции семян.

Предпосевная обработка семян бобовых культур бактериальными препаратами повышает урожайность, устойчивость растений к заболеваниям, увеличивает содержание белка в сене, зерне, пополняет запасы азота в почве, улучшает ее плодородие и структуру. Поэтому они нашли широкое применение. Например в США бактериальные препараты применяются на 20 млн. га, в Англии и Бельгии — на всех площадях, занятых бобовыми [115].

По данным Белорусского научно-исследовательского института почвоведения и агрохимии, применение ризоторфина в дозе 200 — 400 г/га заменяет 45 — 60 кг минерального азота и позволяет получить прибавку зерна бобовых культур (люпина, гороха, вики, кормовых бобов) на 1,5 — 3,0 ц/га, сена клевера 2 — 6, люцерны — 5 — 12 ц/га [115].

Высокая эффективность от применения этого препарата получена и в опытах, проведенных в Брянской сельскохозяйственной академии. Так, предпосевная обработка семян люпина желтого увеличивала урожайность зеленой массы на 17 — 25, а семян — на 9 — 26%. При этом повышалось содержание протеина в зеленой массе с 16,1% (без инокуляции) до 17,6%, а выход протеина с единицы площади возрос на 26,4%. Кроме того, возросло содержание свободных аминокислот в листьях — глутаминовой и аспарагиновой, а также лизина, валина и гистидина [157].

Исследования, проведенные в Беларуси, показали, что более эффективен ризоторфин на легких почвах, в которых менее активна природная популяция азотфиксаторов. Применение его в хозяйствах Беларуси позволило повысить урожайность зернобобовых культур с 8,5 до 15 ц/га [71].

Эффективность работы симбиотического аппарата бобовых растений зависит от количества клубеньков на корнях и их активности, которую можно повысить за счет инокуляции семян бактериальными препаратами.

Исследованиями Е. В. Агафоновым, М. Ю. Стукалова, П. Н. Агафоновой. [1, 2] показано, что обработка семян гороха ризоторфином со штаммом 263 способствовала увеличению количества клубеньков на корнях растений.

В опытах Н. Н. Ельчаниновой, И. Ф. Тимергалиева, Р. А. Хакимовой [74] обработка семян козлятника этим препаратом позволила довести количество клубеньков до 454 шт./м² с общей массой 32,8 г по сравнению с вариантами без инокуляции, где образовалось 330 шт./м² клубеньков с общей массой 26,5 г. В исследованиях П. Т. Пикуна с соавторами [166] применение ризоторфина увеличивало численность клубеньков на корнях клевера лугового на 15,1%, а в опытах Х. М. Унежева [214], массу клубеньков с 219 до 303 кг/га или на 38%.

В настоящее время освоена новая форма симбиотического препарата — сапронит, который по своей эффективности превосходит ризоторфин.

Результаты исследований И. М. Коваль [97] показали, что применение его на люпине способствовало более интенсивному формированию симбиотического аппарата. Так, количество клубеньков в варианте с инокуляцией семян составило 22 — 24 шт. на корень по сравнению 16 шт. на контрольном. Кроме того, применение сапронита повышало полевую всхожесть и выживаемость зернобобовых культур [98].

По данным исследований Т. Ф. Персиковой [164] применение сапронита при инокуляции семян клевера способствовало лучшему развитию микроорганизмов усваивающих азот, число которых на варианте Р₄₀К₆₀ + сапронит составило 1,19* 10⁷ КОЕ/г с. п.

В опытах П. Т. Пикун, М. Ф. Пикун, Т. А. Пилипончик [166] инокуляция семян клевера ползучего этим препаратом повысила выход сухого вещества с гектара на 9,5%, а кормовых единиц и переваримого протеина соответственно на 9,4 и 9,1%.

В исследованиях Л. Н. Лученок [130], Н. А. Михайловской, Н. Н. Куриловича, Л. Н. Лученок [143] инокуляция семян клевера лугового сапронитом обеспечила получение прибавки урожая сухой массы 13,6 ц/га при среднем урожае без инокуляции 79,7 ц/га. В опытах Т. Ф. Персиковой [163, 164] в засушливом 1999 году прибавка урожайности клевера лугового от инокуляции семян этим препаратом составила 10 — 24 ц/га, а в среднем за три года урожайность составила: на фоне Р₄₀ К₆₀ 58, на фоне Р₃₀ К₅₀ — 95 ц/га.

Высокий эффект получен от совместного применения для инокуляции семян бобовых и бобово-злаковых трав симбиотических и ассоциативных азотфиксаторов. Проведение инокуляции семян в опытах Н. А. Михайловской, Т. Б. Барашенко с соавторами [141], Н. А. Михайловской, Л. Н. Лученок, Л. А. Юрко с соавторами [144] оказало положительное влияние на ботанический состав и продуктивность травосмеси — клевер + овсяница + тимофеевка. Бактеризация семян клевера сапронитом и азобактерином по отдельности и двойная инокуляция обеими препаратами повышала его удельный вес в первом и втором укосах до 70 — 90%. Данные Украинского научно-исследовательского института кормов УААН также подтвердили эффективность применения симбиотических и ассоциативных азотфиксаторов [15]. Ими установлено, что люцерна посевная, галега восточная и лядвенец рогатый в смеси с овсяницей тростниковой обеспечили прибавки сухой массы от бактеризации соответственно на 7,4 — 15,1, 7,5 — 13,3 и 2,1 — 10,4 ц/га. Инокуляция оказала положительное влияние на сохраняемость бобовых в травостое.

Результаты исследований Т. М. Шломы [240] показали, что применение бактериального препарата агата 25 К на посевах гороха оказало положительное влияние на формирование урожайности и содержание белка в семенах. Положительный эффект получен также при применении сапронита и совместном применении сапронита и фитостимофоса.

Таким образом, использование симбиотических препаратов для инокуляции семян многолетних бобовых и бобово-злаковых трав является эффективным приемом увеличения содержания в почве биологического азота за счет фиксации его из воздуха, повышения урожайности и качества продукции, снижения ее себестоимости.