Материалы и методы

Исследования проводили на этиолированных проростках ряда сортов озимого ячменя (Hordeum sativum L.). Трилон Б и Актиномицин Д использовали в концентрации указанных в тексте статьи по 10 мл на чашку Петри (9 см в диаметре) и 100 семян ячменя. В каждом эксперименте 2 чашки Петри контрольные (дистиллированная вода) и 2 чашки опытные, каждого сорта. Все эксперименты проводили в темноте, при температуре указанной в тексте статьи в течение 3-х или 4-х суток. В таблицах даны средние арифметические значения роста колеотелей и корней в см.

Изучение этиолированных проростков целесообразно по двум причинам: 1) катионы магния не отвлекаются на синтез хлорофилла и 2) освещение не одинаково сказывается на морозоустойчивости сортов. Так, ранее было показано на зелёных проростках, что два высокоморозоустойчивых сорта Бастион и Радикал имеют прямо противоположную реакцию на освещение [10].

Косвенное изучение сортоспецифических особенностей стабильности долгоживущих мРНК семян озимого ячменя показало, что замачивание семян на растворе актиномицина Д — ингибитора транскрипции — приводит к снижению роста корней 3-х суточных этиолированных проростков. Однако при этом не было выявлено каких-либо различий между сортами, различающимися по морозоустойчивости [15].

Последующие эксперименты в этом направлении были предприняты с 3-х и 4-х суточными проростками с целью выявления возможной временной дифференциации индикаторных сортов, различающихся степенью морозоустойчивости, по реакции на актиномицин Д.

Таблица 1. Действие актиномицина Д на рост корней 3-х и 4-х суточных проростков сортов озимого ячменя, различающихся по морозоустойчивости (актиномицин Д — 40 мкг/мл; при 25^оC).

Переходя к работам с Трилоном Б необходимо было определиться с оптимальными концентрациями этого вещества. Известно, что Трилон Б применяется в качестве ингибитора прорастания томатов в виде водного раствора с концентрацией 6−8 мг/л (1,5Ч10^-5 — 2Ч10^-5 моль/л), а также в качестве ингибитора прорастания семян пшеницы. В то же время он оказывает высокое стимулирующее действие на семена льна и томатов как в обычных для стимуляторов концентрациях 10^-3-10^-5 моль/л, так и в сверхмалых -10^-11-10^-19 моль/л. Причём максимальный эффект достигается при концентрациях 10^-11-10^-15 моль/л [22].

Наши предварительные исследования показали, что Трилон Б в концентрации 10^-2 М оказывал ингибирующее действие на прорастание семян озимого ячменя. При температуре 28^оС всходило только от 1 до 7% семян, в то время как на дистиллированной воде до 30%. Особенно сильно Трилон Б действовал на корни: при этой концентрации на 3-и сутки они достигали лишь 2−3 мм.

Концентрация Трилона Б 10^-6М никак не влияла на прорастание семян озимого ячменя. Оптимальной была признана начальная концентрация 1,6Ч10^-3М, которая при 28^оС подавляла рост и колеоптелей и корней проростков озимого ячменя в среднем на 24%. В дальнейшей работе проводились сравнительные исследования трёх концентраций Трилона Б: 1,6Ч10^-3М, 2,4Ч10^-3М и 3,2Ч10^-3М при разных значениях температуры окружающей среды.

В таблицах 2 и 3 представлены данные сравнительных исследований влияния Трилона Б и актиномицина Д на рост этиолированных проростков многорядного озимого ячменя (Hordeum vulgare) высокоморозоустойчивого сорта Самсон и двухрядного озимого ячменя (Hordeum distichon) слабоморозоустойчивого сорта Агродеум [3].

Из данных, представленных в таблице 2, следует, что снижение роста и колеоптилей, и корней происходило обратно пропорционально концентрации Трилона Б. Но самые большие различия между сортами наблюдались по длине корней при максимальной концентрации Трилона Б — 3,2Ч10^-3М. При этой концентрации длина корней у сорта Агродеум составляла 43% от таковой сорта Самсон. При концентрации 2,4Ч10^-3М — 55%, а при концентрации 1,6Ч10^-3М — 61%.

Длина колеоптилей под влиянием Трилона Б менялась меньше и при минимальной и максимальной концентрациях была сходной у сравниваемых сортов, около 100%. И только при концентрации Трилона Б 2,4Ч10^-3М эта разница составляла 73%.

Таблица 2. Влияние концентрации Трилона Б на рост 3-х суточных этиолированных колеоптилей и корней сортов озимого ячменя Самсон (шестирядный) и Агродеум (двурядный), при температуре 28^оС.

Из представленных в таблице 3 данных следует, что относительно высоко морозоустойчивый сорт Самсон отличался большей интенсивностью роста корней. Его прирост от 3-их до 4-х суток составлял 81% (4,95см — 9,00см), а у относительно слабо морозоустойчивого сорта Агродеум — только 35% (4,47см — 6,03см). При этом актиномицин Д на 3-и сутки снижал рост корней у обоих сортов одинаково (65% и 63% от контроля), но Трилон Б в 2 раза более эффективно снижал рост корней у сорта Агродеум (42% против 81% у Самсона). Кумулятивное действие Трилона Б и актиномицина Д на 3-и сутки было более выраженным также для сорта Агродеум (47% против 61% у Самсона). При этом у сорта Агродеум кумулятивное действие было близко к действию одного Трилона Б (42% и 47%), а у сорта Самсон — ближе к действию одного актиномицина Д (65% и 61%).

Таблица 3. Влияние Трилона Б и актиномицина Д на рост корней этиолированных проростков озимого ячменя при температуре 25^оС (см / % от контроля).

На 4-е сутки картина была иной: действие обоих ингибиторов было практически одинаково на рост корней сравниваемых сортов (у Трилона Б — 50% и 50%, у актиномицина Д — 46% и 54%). Кумулятивное действие на рост, как и на 3-и сутки, было более выраженным для сорта Агродеум — 37%, против 47% у сорта Самсон. При этом кумулятивное действие по снижению роста корней усилилось для сорта Самсон с 61% на 3-и сутки до 47% на 4-е сутки, в то время как для сорта Агродеум этот показатель практически не изменился — 39% и 37%. озимый ячмень колеоптиль трилон Однако при температуре 28^оС всхожесть семян обоих сортов на третьи сутки колебалась лишь в пределах 11−18%.

Помимо кумулятивного действия, для сорта Самсон характерны сравнительно большие колебания показателей между 3-ми и 4-ми сутками: по действию актиномицина Д — 65% и 46%, по действию Трилона Б — 81% и 50%, в то время как для сорта Агродеум — 63% и 54%, 42% и 50%, соответственно. Если взять разницу между показателями 3-х и 4-х суток, то получим для сорта Самсон — актиномицин Д = 19, Трилон Б = 31; для сорта Агродеум — актиномицин Д = 9, Трилон Б = -8. Таким образом, высокоморозоустойчивый сорт Самсон имеет более широкую амплитуду колебаний. Известно, что амплитуда колебаний по ряду молекулярно-биологических показателей шире у высокоморозоустойчивого сорта озимой мягкой пшеницы Краснодарская 39 по сравнению со среднеморозоустойчивым сортом Безостая 1 [11, 16].

В таблицах 4, 5 и 6 представлены данные сравнительных исследований влияния Трилона Б на рост этиолированных проростков сортов Самсон и Ларец. По зимоморозоустойчивости эти два сорта близки. Но по морозоустойчивости сорт Ларец уступает сорту Самсон [14], что вполне согласуется с данными таблиц. Высокая зимоморозоустойчивость сорта Ларец, как известно, в значительной мере определяется глубиной залегания узла кущения [20], а не степенью морозоустойчивости.

Таблица 4. Влияние концентрации Трилона Б на рост 3-х суточных этиолированных проростков озимого ячменя сортов Самсон и Ларец, при температуре 28оС

Данные, представленные в таблицах 5 и 6, были получены в октябре 2015 года. Из таблиц видно, что действие Трилона Б наиболее выражено к этому времени на семенах 2014 года. Это свидетельствует о том, что в перспективе необходимо изучить влияние срока хранения семян на их ростовую реакцию по отношению к Трилону Б.

Таблица 5. Влияние Трилона Б, концентрации 2,4Ч10^-3М, на рост 3-х суточных этиолированных проростков озимого ячменя урожая разных лет, при температуре 28^оС.

Таблица 6. Влияние Трилона Б, концентрации 3,2Ч10^-3М, на рост 3-х суточных этиолированных проростков озимого ячменя урожая разных лет, при температуре 28^оС.

В таблице 7 показано, что высокоморозоустойчивый сорт Самсон и средне морозоустойчивые сорта хорошо различаются по ростовой реакции под влиянием Трилона Б только при высокой его концентрации.

Так как все выше приведённые данные свидетельствуют о том, что корни проростков наиболее чувствительны к действию Трилона Б, дальнейшие исследования проводились только по измерению корней проростков.

Таблица 7. Влияние концентрации Трилона Б на рост 3-х суточных этиолированных проростков озимого ячменя высокоморозоустойчивого сорта Самсон и ряда среднеморозоустойчивых сортов, при температуре 28^оС.

Ингибирование роста Трилоном Б зависит от исходной интенсивности роста корней: чем интенсивнее рост, тем эффективнее действие Трилона Б. Это наиболее ярко продемонстрировано при исследовании влияния количества семян на чашку Петри (табл. 8). Увеличение количества семян вдвое приводило к существенному снижению интенсивности роста корней. При этом эффективность действия Трилона Б снижалась. В наибольшей степени для сорта SZD7385: 2,15 см — нет действия; 3,11 см — снижение роста на 40%. Для сорта Самсон: 3,77 см — снижение роста на 50%; 4,65 см — снижение роста на 70%.

Эта закономерность характерна и для ряда среднеморозоустойчивых сортов. Интенсивность их роста чаще всего превосходила другие сорта и сопровождалась относительно выраженной реакцией на действие Трилона Б (табл. 7, 9, 10). Вероятно, это связано с повышенным содержанием в их зерне предобразованных, долгоживущих нуклеиновых кислот, с чем связано повышенное содержание водоэкстрагированного магния [7].

Таблица 8. Влияние Трилона Б на рост корней (см) озимого ячменя при разном количестве посеянных семян (3-е суток, температура 22^оС).

Как следует из таблиц 9 и 10 Трилон Б эффективно дискриминировал по морозоустойчивости сорта Российского происхождения: высокоморозоустойчивый сорт Добрыня-3 достоверно отличался от среднеморозоустойчивых сортов Кондрат, Гордей, Кубагро 1 и Кубагро 3, которые в свою очередь достоверно отличались от слабоморозоустойчивого сорта Агродеум. Наиболее эффективной была концентрация Трилона Б 3,2Ч10^-3М при температуре 22^оС (табл. 9).

Однако зарубежные слабоморозоустойчивые сорта отклонялись от этой закономерности и давали результаты средние между высокоморозоустойчивым и среднеморозоустойчивым сортами (табл. 10). Эта проблема является предметом дальнейших исследований. Для её решения необходимо понять характер взаимоотношений долгоживущих рРНК и мРНК и влияния на их судьбу количества катионов магния в зрелом зерне ячменя.

В процессе набухания семян при их замачивании начинается мобилизация питательных веществ — жиров, белков и полисахаридов. Происходит перевод их в растворимые соединения, легко используемые для питания зародыша. Для этого необходимы соответствующие ферменты. Частично ферменты находятся в эндосперме в связанном состоянии и под влиянием замачивания переходят в активное состояние. Ферменты синтезируются и de novo. Для этого необходимы соответствующие мРНК [1].

Таблица 9. Изменение роста корней 3-х суточных проростков озимого ячменя под влиянием разных концентраций Трилона Б, при температуре 25^оС.

Таблица 10. Изменение роста корней 3-х суточных проростков озимого ячменя под влиянием Трилона Б, концентрации 3,2Ч10^-3М, температура 22^оС.

В покоящихся семенах присутствуют одни мРНК, а другие мРНК синтезируются с первых этапов прорастания семян. Согласно современным представлениям мРНК в прорастающих семенах можно разделить на три типа (по времени образования). К первому типу можно отнести и так называемую предсуществующую (предобразованную — остаточную) мРНК, которая транскрибирована с ДНК ещё в период эмбриогенеза семян. Эта РНК использовалась в эмбриогенезе для синтеза белков и теперь в процессе прорастания вновь может быть использована. Однако её немного и роль её невелика. Ко второму типу относится мРНК, также транскрибированная в эмбриогенезе, однако не прошедшая процессинга и поэтому неактивная. В процессе набухания она проходит все необходимые превращения (процессинг) и обеспечивает синтез белков, специфичных для прорастания, главным образом ферментов гидролиза. Третий тип — это новообразованная РНК, которая появляется через 1−2 ч после замачивания. Эта РНК транскрибируется с ДНК в процессе прорастания РНК-полимеразой-1 и также ответственна за синтез специфических белков-ферментов. Существуют данные, что в синтезе белка при прорастании сначала участвуют рибосомы, образованные ещё при эмбриогенезе, затем, начиная примерно с восьми часов от намачивания семян, происходит усиленное образование рибосомной РНК и формируются новые рибосомы [21] .

Поскольку мРНК, запасённая в семенах, отвечает практически за весь синтез белка на ранних стадиях прорастания, несомненно, что эта РНК необходима и для самого процесса прорастания.

Синтез белков в живых клетках (in vivo) и в бесклеточных системах (in vitro) осуществляется рибосомами, которые организованы в крупные ассоциаты с мРНК таким образом, что одну цепь мРНК одновременно транслируют, двигаясь по цепи друг за другом, несколько или даже много рибосом. Структура, в которой мРНК ассоциирована со многими транслирующими рибосомами, получила название полирибосомы, или полисомы.

Создание бесклеточных систем трансляции с продолжительным временем жизни позволило проводить систематические исследования структурной организации полирибосом и их конформационных изменений в течение многих последовательных раундов трансляции. Удобными для этой цели оказались бесклеточные системы на основе экстракта из зародышей пшеницы, т.к. они не содержат эндогенных мРНК, что позволяет следить за формированием и структурными превращениями полисом, образованных на добавленной мРНК [19].

В середине 60-х годов ХХ века в серии классических экспериментов на семенах хлопка, пшеницы и земляного ореха было установлено, что покоящиеся семена, также как и зрелые ооциты животных, содержат запас предобразованных мРНК [4, 23, 27, 28, 32]. Экстракт из зародышей пшеницы обладает слабым эндогенным синтезом, так как в семенах пшеницы примерно через час после их замачивания в воде наблюдался синтез белка, интенсивность которого составляла 28% максимально возможной. Это позволяет предполагать, что какое-то количество долгоживущих мРНК зародыши пшеницы всё-таки содержат. Уже через 3−5 часов после замачивания синтетическая активность достигает максимальной — 65%. Вместе с тем, показательно, что рибосомы, выделенные из семян до активации (до замачивания), не способны синтезировать белок, однако при добавлении экзогенных РНК-матриц в них начинается синтез белка [4, 28].

Известно, чем выше содержание катионов магния в рРНК, тем она стабильнее (большее время жизни). При высоком содержании магния способность in vitro строить полипептиды приобретают многие синтетические мРНК. При более низких концентрациях, синтез могут вести только те РНК, в которых присутствуют инициирующие кодоны АУГ и ГУГ [18]. Каким образом магний инициирует синтез? На этот вопрос нет однозначного ответа. Тем не менее, установлено, чем больше содержится магния в рРНК, тем активнее синтезируют белок (полифенилаланин) рибосомы зародышей пшеницы в бесклеточной системе синтеза белка (in vitro) на искусственной матрице (поли-У) [31].

Ранее было показано, что морозоустойчивость озимой мягкой пшеницы прямо пропорциональна периоду полужизни мРНК и 25S рРНК, но обратно пропорциональна периоду полужизни 18S рРНК и содержанию катионов Mg⁺⁺ в РНК[6, 8, 11, 16]. Вероятно, этим можно объяснить факт сортоспецифического усиления in vitro трансляционной активности полисом из проростков пшеницы и ячменя под влиянием закаливающей температуры [5], тогда как в этих условиях длина поли-А-хвоста мРНК (энхансера трансляции) у пшеницы увеличивалась, а у ячменя сокращалась [2, 11]. Но ячмень содержит гораздо больше катионов магния по сравнению с пшеницей [6, 7], что, возможно, и определяло увеличение трансляционной активности рибосом ячменя.

Следовательно, увеличение трансляционной активности полирибосом может происходить как за счёт увеличения длины поли-А-хвоста мРНК как энхансера трансляции (пшеница), так и за счёт увеличения содержания катионов магния в рРНК (ячмень). Эта принципиально важная гипотеза требует детальной экспериментальной проверки.

Семена растений могут оставаться в покоящемся состоянии чрезвычайно долгое время — годы. Так семена пшеницы и ячменя сохраняют хорошую всхожесть не менее 5 лет. Исключительным примером в этом отношении является лотос: семена этого растения (Nelumbo lucefera), сохранившиеся в отложениях, возраст которых превышает 1700 лет, оказались живыми и способными к прорастанию [4, 27].

К наиболее интересным примерам генных продуктов с очень большой продолжительностью жизни можно отнести матричную РНК, синтезированную в оогенезе и длительнее время хранящуюся в яйцах многих животных. В семенах различных растений также содержатся молекулы мРНК с исключительно большой продолжительностью жизни. Также как в яйцах морского ежа после оплодотворения или партеногенетической активации, увеличение интенсивности белкового синтеза в семенах растений, всегда связано с появлением новых полисом [4].

Опыты с применением актиномицина Д показали, что полисомы образуются из компонентов, синтезированных ранее и сохранившихся в тканях семени. Сборка этих полисом не зависит от синтеза de novo мРНК. Например, когда количество актиномицина Д достаточно для полного подавления синтеза РНК, характер распределения полисом в градиенте плотности сахарозы остаётся таким же, как и в контроле. На скорость синтеза белка в активированных семенах актиномицин Д также не влияет [4].

Как показали электронномикроскопические исследования, рибосомы, плотно упакованные в сухих семенах гороха, при замачивании объединяются в полисомные структуры. Причём у этого вида растений во время прорастания РНК не синтезируется [25]. Возможно, этим объясняется хорошая корреляция между морозоустойчивостью зимующего гороха, выведенного в КНИИСХ им. П. П. Лукьяненко, и количеством РНК в его зрелых зернах [14, 16].

Для отечественных сортов озимого ячменя одним из важнейших адаптивных признаков является морозоустойчивость. Поэтому в селекции озимого ячменя особенно остро стоит проблема повышения его морозоустойчивости. Трудности селекции на зимоустойчивость определяются многими причинами; это сложный признак, включающий морозоустойчивость — главный компонент успешной перезимовки, а также глубину залегания узла кущения, устойчивость к «выпиранию» и к образованию ледяной корки. Показано, что зимоустойчивость растений зависит от генотипа, условий закалки, стадии развития.

Экспериментально была установлена взаимосвязь между морозоустойчивостью сортов озимого ячменя и водоудерживающей способностью (гигроскопичностью) зрелого зерна. На примере десятков сортов показано, что чем выше морозоустойчивость сорта, тем меньший объём надосадочной жидкости может быть получен при экстракции шрота ячменя раствором, содержащим катионы магния. Результаты сравнительных исследований морозоустойчивости по степени выживания растений при промораживании в холодильных камерах и по степени гигроскопичности зрелого зерна показали, что эти два метода оценки морозоустойчивости дают весьма близкие данные. Вместе с тем, по простоте и низким экономическим затратам предлагаемый метод оценки морозоустойчивости во много раз превосходит метод прямого промораживания растений [12, 13].

Однако, разрешающая способность нового метода существенно не превышает таковую метода прямого промораживания (НСР=0,05 для различий по морозостойкости в 8−10%), а для эффективной селекции, по мнению академика В. М. Шевцова (1940;2012), желательны различия в 2 раза большие. Дальнейшие исследования показали возможность увеличить разрешающую способность этого лабораторного метода за счет дополнительного анализа содержания в зрелом зерне ячменя экстрактивного магния, которым особенно богаты среднеморозоустойчивые сорта [7].

Этот методический приём позволяет подразделить сорта на три группы морозоустойчивости. Однако метод сопряжен с необходимостью разрушения зерна, навески параллельных проб шрота, его экстракцией дистиллированной водой (отделение от шрота центрифугированием или фильтрацией) и оценкой содержания магния в экстракте фотометрическим методом окрашивания титановым жёлтым. Для этого необходима мельница, весы, центрифуга или оборудование для фильтрации, спектрофотометр или колориметр. Чтобы снизить стоимость и трудозатраты метода была проведена работа по изучению прорастания зерна озимого ячменя на растворе динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, результаты которой, представленные в настоящей статье, показывают, что сложный замер количества экстрактивного магния можно заменить исследованием интенсивности роста проростков семян, проращиваемых на растворе этого вещества, эффективно связывающего двухвалентные катионы.

Основные выводы: 1) отсутствие сортоспецифического действия актиномицина Д говорит о том, что по стабильности мРНК семена сравниваемых сортов озимого ячменя не различаются; 2) наличие сортоспецифического действия Трилона Б предполагает значительную роль рибосомных РНК в формировании морозоустойчивости озимого ячменя; 3) при дальнейших исследованиях проращивание семян на растворе Трилона Б может оказаться самым простым и эффективным приёмом для оценки морозоусточивости сортов озимого ячменя.