Микробиологический синтез триптофана

Наряду с лизином разработаны промышленные технологии получения кормовых и высокоочищенных препаратов другой незаменимой аминокислоты — триптофана. Для производства этой аминокислоты применяют как одноступенчатый синтез с помощью бактериальных ауксотрофных мутантов с нарушенной регуляцией синтеза аминокислот, так и двухступенчатый синтез, включающий вначале получения предшественника триптофана, а затем его ферментативное превращение в конечный продукт — триптофан. У бактерий и многих других организмов аминокислота триптофан образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной кислоты через ряд последовательных реакций, включающих образование шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшественником триптофана в процессе его синтеза является антраниловая кислота. Синтез триптофана аллостерически ингибируется конечными продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие начальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой кислоты. Для смещения метаболических реакций по пути преимущественного образования триптофана необходимо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую (схема 2). Это достигается действием мутагенных факторов. У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается повышенный синтез аминокислоты триптофана, однако для нормального развития этих мутантов в питательную среду необходимо добавлять дефицитные аминокислоты — фенилаланил и тирозин — в количествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов синтеза триптофана. Для промышленного получения триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов бактерий Basccillus sibtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина.

Схема 2.

Все технологические организованы примерно по такой же схеме, как и получение лизина с помощью мутантов коринебактерий. Ферментация длится 48 часов при 37 °C, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и высушивается при 110−120°С. Высушенный продукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ). При получении высококонцентрированных препаратов триптофана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистке. Вначале ее подкисляют соляной кислотой до рН 1,0 и затем центрифугированием отделяют образовавшийся осадок. Далее цетрифугат, содержащий триптофан, пропускают через ионо-обменные колонки с катионитом, в результате происходит связывание аминокислоты и, таким образом, отделение ее от культуральной жидкости. После промывки колонок производят десорбцию триптофана 5%-ным раствором аммиака в смеси изопропанола и воды. Элюат направляют на вакуумный выпариватель, после чего кристаллизуют аминокислоту при 4 — 8єС. Выделенную в кристаллическом виде соль триптофана промывают этанолом и высушивают под вакуумом при 60єС. Высушенный кристаллический препарат содержит не менее 99% триптофана в виде его хлорида. Осадок после отделения культуральной жидкости, содержащий клетки культуры бактерий, также высушивают и используют как высокобелковую кормовую добавку, содержащую, кроме того, повышенное количество триптофана. Синтез триптофана в нашей стране производится преимущественно по двухступенчатой схеме. Вначале методом химического синтеза получают предшественник триптофана — антраниловую кислоту, которую затем с участием ферментов микробного происхождения превращают в триптофан. Биохимическое превращение антраниловой кислоты в триптофан проходит в три этапа. На первом этапе из антраниловой кислоты с участием фосфорибозилфосфата образуется аминогликозид — N- (5ґ-фосфорибозил) — антраниловая кислота, которая в результате внутримолекулярной перегруппировки и декарбоксилирования превращается в индол-3-глицерофосфат. На последнем этапе под действием фермента триптофансинтетазы из индол-3-глицерофосфата и аминокислоты серина образуется триптофан. В связи с тем, что в качестве активной группы у фермента триптофансинтетазы служит пиридоксальфосфат, от наличия в среде этого кофермента зависит скорость превращения антраниловой кислоты в триптофан. В качестве источника ферментов для указанных реакций используются дрожжи C. Utilis. Производственный процесс биохимического превращения антраниловой кислоты в триптофан проводится в две стадии. На первой стадии производится наращивание биомассы дрожжей, являющихся продуцентами ферментов. Питательная среда для выращивания дрожжей готовится из свекловичной мелассы, мочевины и минеральных солей. Ферментация продолжается в течение 24 ч при 30єС. Далее в ферментер начинают вводить спиртовой 5%-ный раствор антраниловой кислоты и 50%-ный раствор мочевины. Через 3 — 4 ч после добавления антраниловой кислоты в ферментер дополнительно подается углеродный субстрат — меласса в виде 25%-ного раствора. На последующих этапах ферментации периодически производится подача антраниловой кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы — через каждые 12 ч. Длительность ферментации около 120 ч, а с учетом времени наращивания биомассы дрожжей — 144 ч. Содержание триптофана в культуральной жидкости составляет 0,3 — 0,5% или примерно 6 г/л.