Анализ ассоциации полиморфных генов основных цитокинов с синдромом раздраженного кишечника

В статье представлены результаты исследования иммуногенетической составляющей синдрома раздраженного кишечника. Установлены особенности частот встречаемости аллелей и генотипов генов цитокинов IL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa у больных СРК. Проведен иерархический логлинейный анализ для выявления ассоциации комбинаций генотипов с предрасположенностью к синдрому раздраженного кишечника. Установлены комбинации генотипов генов цитокинов, обладающие протекторными свойствами при СРК: внутригенная комбинация -308G/G- -863 C/A гена TNFa и межгенная комбинация провоспалительных цитокинов IL-1b+3953 C/C- -863C/A TNFa. Выявлены гендерные различия в распределении полиморфизма цитокинов у больных СРК.

Синдром раздраженного кишечника (СРК) является одной из наиболее актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Особенностями проблемы СРК являются: высокая распространенность полисистемных жалоб, отсутствие четких диагностических маркеров, ограничение спектра эффективных методов лечения, направленных на биологические дефекты. В большинстве работ СРК рассматривается как хронический абдоминальный симптомокомплекс [1].

Распространенность СРК в большинстве стран мира составляет в среднем 20%, варьируя от 9 до 48% [2]. В развитых странах Европы, Америки, в Японии, Китае обращаемость высока и распространенность заболевания достигает 30%; в Таиланде — 5%, в Иране — 3,4%. Пик заболеваемости приходится на трудоспособный возраст — 30−40 лет. Соотношение женщин и мужчин среди больных, по разным данным, варьирует от 1:1 до 2:1. Средний возраст пациентов составляет 24−41 год [2].

Развитию СРК могут предшествовать личностные особенности, обусловленные генетически или сформировавшиеся под влиянием окружающей среды [3]. В качестве генетической составляющей СРК изучаются генетический полиморфизм, вовлеченный в обмен серотонина, адренэргической и опиоидной систем, а также гены, кодирующие белки с иммуномодулирующими и/или нейромоду-лирующими свойствами. Среди генов-кандидатов СРК в зарубежных источниках рассматриваются: SLC6A4 — ген серотонин-транпспортера, ген а-2адренэргического рецептора, СОМР-ген катехол-о-метилтрансферазы, GNB3 — ген Р3 субъединицы G-белка и т. д. [3].

Сегодняшние представления о патофизиологии СРК позволяют предположить, что в основе запуска или усиления патологического процесса лежит комбинация факторов — недостаточная или избыточная активация иммунной системы и дисбиоз кишечника. Участие цитокинов в патофизиологических процессах при СРК подтверждают данные лабораторных исследований: снижена экспрессия иммунорегуляторных цитокинов и повышена экспрессия провоспалительных цитокинов [4−6].

В связи с тем, что продукция цитокинов находится под генетическим контролем, то можно предположить, что генетические полиморфизмы определенных цитокинов могут выступать в качестве факторов, определяющих чувствительность персоны к развитию патологии и влияющих на вариабельность клинических проявлений СРК.

Цель: установить распределение частот аллелей, генотипов и сочетаний генотипов генов основных цитокинов IL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa у больных синдромом раздраженного кишечника европеоидного происхождения, проживающих на территории Челябинской области.

Задачи:

• 1. Оценить частоты встречаемости аллелей и генотиповIL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa у больных СРК в сравнении с условно-здоровыми представителями русской популяции.
• 2. Выявить особенности распределения полиморфизма геновIL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa в зависимости от пола у больных СРК.
• 3. Оценить ассоциацию межгенных и внутригенных взаимодействий L-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa в виде сочетаний генотипов генов цитокинов с восприимчивостью к СРК.

Материал и методы

В исследование включен 81 человек русской этнической группы с диагнозом СРК. Пациенты находились на лечении в гастроэнтерологическом отделении Дорожной клинической больницы МПС на станции «Челябинск» в период с 2001 по 2007 гг. Для диагностики заболевания использовались Римские критерии III (2007). Средний возраст начала заболевания составил 32,8±1,4 лет, длительность заболевания в среднем от 3 до 10 лет у половины пациентов. Обследования пациентов проводились по утвержденным Медико-экономическим стандартам Министерства здравоохранения 1998 г.

Контрольную группу составляли потенциальные доноры костного мозга ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови»: 213 человек, из них мужчин — 119 (55,9%), женщин — 94 (44,1%). Средний возраст составил 34,6±0,75 лет. Этническая принадлежность больных СРК и здоровых лиц определялась согласно рекомендациям Международного Уоркшопа (1980 г., Лос-Анджелес, США). Демографическая характеристика обследуемых групп представлена в таблице.

Таблица.

Демографическая характеристика обследуемых групп

Характеристика исследуемых полиморфизмов. Гены IL-1b и IL-1Rа расположены на второй хромосоме в районе 2q12 [7, 8]. Для исследования полиморфизма по одному нуклеотиду (SNP) в 5 экзоне гена IL-1b (положение +3953) использовали разновидность ПЦР — ПДРФ — анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В основе метода лежит ПЦР, с последующей обработкой ампликонов ферментом эндонуклеазой рестрикции Taq I при температуре +65 °С в течение 8 часов.

При гидролизе амплификационного фрагмента гена IL-1b выявлялось три фрагмента размером 550 п.н., 146 п.н. и 404 п.н. Фрагмент 550 п.н. соответствует амплификационному фрагменту, не подвергнувшемуся гидролизу, что указывает на наличие аллеля IL-1b (+3953) Т, гомозиготное состояние обозначено m/m (сокращение от mutant — мутантный аллель). При наличии аллеля C происходит разрезание ампликона на два фрагмента — 146 п.н. и 404 п.н., гомозиготность по этому аллелю обозначена w/w (сокращение от wild — аллель дикого типа), а гетерозиготное состояние С/Т в данном исследовании обозначено как w/m [8, 9]. Для определения полиморфизма типа варьирующего числа тандемных повторов (VNTR) в гене IL-1Ra использовали ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находится VNTR участка длиной 86 п.н. В результате амплификации мы идентифицировали фрагменты ДНК размером 438, 524, 610, и 696 н.п., соответственно с 2, 3, 4 и 5 копиями тандемных повторов [8−10]. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R в данном исследовании. иммуногенетический раздраженный кишечник цитокин.

Ген IL-4 расположен на длинном плече 5 хромосомы [8, 9]. Для исследования VNTR IL-4 проводили ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах 3-го интрона, в котором находится вариабельное количество тандемных повторов размером 70 н.п. В результате амплификации идентифицировали фрагменты ДНК размерами 255 и 325 н.п. соответственно, с 2 и 3 копиями тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R и 3R [9]. Наборы для типирования генов цитокинов синтезированы группой фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН). Детекция полученных ампликонов проводилась методом вертикального электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле.

Ген TNFa располагается в пределах главного комплекса гистосовместимости МНС и относится к генам HLA III класса. Он отстоит на 600 кДа от локуса HLA-В и характеризуется высоким количеством SNPs в промоторной области, наиболее известными являются положения -308, -238. Однако есть и другие полиморфизмы типа SNP, например, -863, способные также влиять на экспрессию TNFa [7, 11]. Типирование SNPs в гене TNFa — ПДРФ — анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов: амплификация с последующей обработкой ампликонов эндонуклеазами рестрикции NcoI (37 °С в течение 16 часов) для положения -308 (G/A), TaiI для положения -863 (65 °С в течение 8 часов). Детекция результатов — электрофорез в 8% ПААГе.

Статистическая обработка. В работе использовались стандартные иммуногенетические критерии: критерий X2 — для 1 степени свободы и выше, критерий X2 с поправкой Йетса на непрерывность применялся для одной степени свободы, когда абсолютные частоты были меньше 10, критерий Фишера использовался при абсолютных частотах меньше 5. Для анализа ассоциации комбинаций генотипов с восприимчивостью к СРК применялся иерархический логлинейный анализ, в котором рассчитывался критерий максимального правдоподобия (G) и отклонения Фримана-Тьюки. Для оценки вероятности возникновения признака (заболевания или какой-то клинической характеристики) в зависимости от генетического варианта (аллеля, генотипа, комбинации генотипов) применялся критерий отношения шансов (OR) с расчетом 95%-ного доверительного интервала (CI) — отношение шансов в одной группе к шансам этого же события в другой группе. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р 0,10; для промежуточных значений р (0,05 <�р < 0,10) обсуждали тенденцию к различиям [12].

Результаты и их обсуждение

1. На первом этапе был проведен анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов генов исследуемых цитокинов в группах больных СРК и условно-здоровых лиц русской популяции Челябинской области. Частоты встречаемости аллелей и генотипов геновIL-1Ra, IL-1b, IL-4, -308G/ATNFa не отличались между исследуемыми выборками. Различия были установлены только для частот аллелей и генотипов в точке -863TNFa (на уровне тенденции).

Группа больных СРК характеризовалась сниженной частотой аллеля с заменой -863* А, связанного с повышением продукции TNFa [11] и повышенной частотой другого — частого аллеля -863*С (на уровне тенденции X2 = 3,23, p = 0,0722 для одной степени свободы), но по критерию отношения шансов (OR) такое перераспределение частот аллелей не имеет диагностической значимости (OR = 0,57 95%CI 0,3−1,06).

Больные СРК также отличались от условно-здоровых лиц повышенной частотой генотипа -863 СС TNFa (82,5% против 72,8%, X2 = 2,97, p = 0,0848 для одной степени свободы, на уровне тенденции), но как маркер предрасположенности к СРК данный генотип выступать, вероятно, не может, так как расчет критерия OR показал, что его доверительный интервал находится в диапазоне, захватывающем единицу: OR = 1,76 95%CI 0,92−3,39.

Таким образом, установленные изменения частот аллелей и генотипа СС полиморфного сайта -863 промоторной области гена TNFa могут быть особенностью группы больных СРК, но не являются маркерами группы риска СРК.

2. Вторая задача посвящена рассмотрению наличия или отсутствия изменений в частотах встречаемости аллелей и генотипов генов цитокинов у больных СРК в зависимости от пола. У женщин, больных СРК, выявлены следующие особенности.

IL-1Ra. Повышена частота аллеля 2R IL-1Ra (на уровне тенденции, X2 = 2,82, p = 0,093 OR = 1,54, 95% CI 0,93−2,5) за счет увеличения количества носителей гомозиготного генотипа 2r/2r (p = 0,09 OR = 2,64, 95% CI 0,88−7,9). Однако общий эффект взаимодействия между частотами аллелей и генотипов IL-1Ra и предрасположенностью к СРК у женщин оказался незначительным.

IL-1b. В ходе анализа был показан вклад +3953 SNP IL-1P в предрасположенность к СРК у женщин (G = 6,64, df = 2, p = 0,036). Обнаружено, что статистически значимый эффект достигался за счет изменения частоты генотипа T/T (0% против 9,57% в контроле, р = 0,013).

TNFa -308 G/A. Еще одной особенностью являлось изменение частот генотипов SNP -308 G/A TNFa у практически здоровых и больных СРК женщин (на уровне тенденции). Группа больных СРК характеризовалась повышенной частотой гетерозиготного генотипа -308G/A (33,9% против 20,21%, X2 = 3,57 p = 0,06, OR = 2,02 95%CI 0,96−4,26) и пониженной частотой гомозиготного генотипа G/G -308 TNFa (64,41% против 77,66%, X2 = 3,20p = 0,07, OR = 0,52 95%CI 0,25−1,08). Однако по критерию отношения шансов такое изменение частот не имело прогностического значения для расчета вероятности развития предрасположенности к СРК у женщин.

Частоты аллелей и генотипов IL-4, -863 C/A TNFa не различались между исследуемыми группами.

Несмотря на то, что группа мужчин, страдающих СРК, была значительно меньше группы женщин, анализ распределения частот встречаемости аллелей и генотипов генов цитокинов у практически здоровых и больных СРК мужчин позволил выявить различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов IL-1Ra и гомозиготного генотипа по редкому аллелю -308 A/A TNFa. У мужчин, страдающих СРК, чаще встречался генотип -308 A/A TNFa (9,09% против 0,84%, p = 0,064, OR = 11,8 95% CI 0,99−139,2), несмотря на то, что благодаря такому распределению частот общий эффект оказался значим на уровне тенденции.

Более информативными были различия в распределении частот встречаемости аллелей и генотипов IL-1Ra. У мужчин, страдающих СРК, снижены частоты аллеля 2R и его гетерозиготного генотипа 4R/2R по сравнению с контролем. Согласно критерию отношения шансов носительство аллеля с 2-кратным повтором уменьшает вероятность возникновения СРК по сравнению с носительством других аллелей IL-1Ra (OR=0,38 95% CI 0,15−0,94), но только в гетерозиготном состоянии вместе с аллелем 4R (OR=0,31 95% CI 0,097−0,97). В свою очередь присутствие аллеля 4R в гомозиготном состоянии повышает вероятность развития СРК у мужчин: для носительства аллеля 4R коэффициент OR составил 2,4 95% CI 1,012−5,62, для генотипа 4R/4R — OR = 3 95% CI 1,09−8,27.

Таким образом, выделение групп больных по полу позволило установить маркеры предрасположенности к СРК среди исследуемых генов цитокинов отдельно для женщин и мужчин, тогда как при объединении в общую выборку установленные различия нивелировались.

3. Оценка ассоциации межгенных и внутригенных взаимодействий с предрасположенностью / устойчивостью к СРК проводилась с помощью иерархического логлинейного анализа.

Установлена значимость следующих комбинаций генотипов: протекторными свойствами обладали комбинации генотипов SNPs TNFa -308G/G- -863 C/A (11,25% vs 23,0% X2 = 4,35, p = 0,0371, OR = 0,57 95%CI 0,19−0,91), IL-1b+3953 C/C- - 863C/A TNFa (6,25% vs 16,43 X2 = 4,29, p = 0,0384 OR = 0,34 95%CI 0,13−0,9). По нашему мнению, ведущее значение в данных комбинациях отводится гетерозиготному генотипу — 863C/A TNFa.

Выводы.

• 1. Особенность больных СРК европеоидного происхождения — повышенная частота гомозиготного генотипа -863С/С генаTNFa.
• 2. Установлены маркеры, снижающие вероятность развития СРК: у женщин — гомозиготный генотип Т/Т +3953 IL-1b, у мужчин — аллель 2r и генотип 4r/2r генаIL-1Ra.
• 3. Выявлены комбинации генотипов генов цитокинов, обладающие протекторными свойствами при СРК: внутригенная комбинация -308G/G- -863 C/A генаTNFa и межгенная комбинация генов провоспалительных цитокиновIL-1b+3953 C/C — - 863C/ATNFa.

Заключение

В патогенез каждого заболевания вовлекается много разных функционально взаимосвязанных генов той или иной локальной генной сети. Наряду с главными генами, провоцирующими начало болезни, всегда присутствуют другие, второстепенные, в том числе многочисленные гены-модификаторы, фенотипические эффекты которых во многом определяются средовыми факторами. К таким генам относятся гены воспаления, в частности гены цитокинов. Их идентификация, выявление характера функциональных поломок на уровне локальных генных сетей, особенностей ген-генных взаимодействий при мультифакторной патологии являются важными задачами постгеномной информатики и персонализированной медицины. Наше исследование вносит вклад в развитие представлений об иммуногенетической компоненте синдрома раздраженного кишечника.

• 1. Бурмистрова А. Л. Иммунный гомеостаз и микросимбиоценоз. Метаморфозы и пути развития воспалительных заболеваний. — Челябинск: Челябинский Дом печати, 1997. — 216 с.
• 2. Ивашкин В. Т., Шептулин А. А. Избранные лекции по гастроэнтерологии. — М.: Медпресс-информ, 2002. — 85 с.
• 3. Hotoleanu C., Popp R., Trifa A.P., Nedelcu T., Dumitrascu D.T. Genetic determination of irritable bowel syndrome // World Journal of Gastroenterology. — 2008. — 14, No. 43. — P. 6636−6640.
• 4. Родионова О. Н., Бабаева А. Р. Патогенетическая роль сывороточных цитокинов при синдроме раздраженного кишечника // Цитокины и воспаление. — 2011. — Т. 10., № 3. — С. 45−48.
• 5. Oscar R.-F., Hernandez-Ruiz J., Schmulson M. From cytokines to toll-like receptors and beyond — current knowledge and future research needs in irritable bowel syndrome // Journal of Neurogastroenterology and Motility. — 2010. — 16. — P. 363 373.
• 6. Saito Y.A., Talley N.J. Genetics of Irritable bowel syndrome // American Journal of Gastroenterology. — 2008. — 103.2100−2104.
• 7. Рыдловская А. В., Симбирцев А. С. Функциональный полиморфизм генаTNFa и патология // Цитокины и воспаление.
• 8. — Т. 4, № 3. — С. 4−10.
• 9. Шабалдин А. В., Филипенко М. Л., Воронина Е. Н., Глушков А. Н., Симонова Т. А. Полиморфизм генов антагониста рецептора инерлейкина-1 и интрерлейкина-4 при репродуктивных нарушениях // Иммунология. — 2005. — № 1. — С. 6−9.
• 10. Бурмистрова А. Л., Сташкевич Д. С., Суслова Т. А., Девальд И. В., Исаканова А. О., Димчева О. Н. Молекулярно-генетический анализ полиморфизмов генов цитокинов — интерлейкина-1р, рецептора антагониста интерлейкина-1 и интер-лейкина-4 у больных ревматоидным артритом башкирской этнической группы, проживающих в Челябинской области // Медицинская иммунология. — СПб.: Человек, 2007. — Т. 9, № 6. — С. 631−634.
• 11. Carreira P.E., Gonzalez-Crespo M.R., Ciruelo E. et al. Polymorphism of the Interleukin-1 Receptor antagonist gene a factor in susceptibility to rheumatoid arthritis in a Spanish population // Arthritis & — 2005. — Vol. 52. — P. 3015−3019.
• 12. Heesen M., Kunz D., Wessiepe M. et al. Rapid genotyping for tumor necrosis factor-a (TNFa) -863C/A promoter polymorphism that determines TNF-a response // Clinical Chemistry. — 2004. — 50. — P. 226−228.
• 13. R., Rolf F.J. Biometry: the principles and practice of statistics in biological research. — N.Y.: Freeman & Co, 1995.