Результаты и их обсуждение

Влияние нейротрофического фактора головного мозга на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей диссоциированных культур клеток гиппокампа на разных этапах развития in vitro.

Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа на 7 день развития in vitro

На 3−4 день развития in vitro спонтанная биоэлектрическая активность представляла собой последовательность спонтанных внеклеточных потенциалов действия (спайков) длительностью 1,5 мс и амплитудой 25±2,4 мкВ, регистрируемых на 64 электродах мультиэлектродной матрицы MED64 (Alfa MED Science, Япония) (рис. 7).

Рисунок 7. Пример записи спонтанной биоэлектрической активности, регистрируемой с 1 электрода мультиэлектродной матрицы MED64 (Alfa MED Science, Япония): А — запись на 4 день развития культуры in vitro; Б — запись на 5 день развития культуры in vitro; В — запись мини-пачек на 7 день развития культуры in vitro; Г — запись сетевых пачек с 4-x электродов на 7 день развития культуры in vitro.

На 7-й день развития диссоциированных культур клеток гиппокампа in vitro происходило формирование сетевой пачечной активности, представленной в виде последовательности спайков, возникающих на разных электродах матрицы с коротким интервалом следования (1−50 мс) (рис. 7 В). Промежуток времени между окончанием одной сетевой пачки и возникновением другой варьировал от 5 до 20 сек.

На 7-й DIV в среду культивирования добавляли нейротрофический фактор BDNF в конечной концентрации 0,1 нг/мл и 1 нг/мл. Контрольной группе культур осуществлялась аппликация раствора альбумина в PBS. Регистрацию спонтанной биоэлектрической активности проводили в исходном состоянии, в течение 30 минут после добавления веществ и через 24 часа.

В результате проведенного исследования было показано, что в ответ на аппликацию BDNF спонтанная биоэлектрическая активность не изменялась как в течение 30 минут поле воздействия, 2 часов, так и через 24 часа. Установлено, что параметры «количество малых сетевых пачек/5 мин», «количество спайков в сетевой пачке», «длительность малой cетевой пачки импульсов» статистически достоверно не отличались от исходного уровня как в контрольной, так и в опытных группах (рис. 8 А, Б, В).

Однако седует отметить, что при анализе структуры индивидуальной сетевой активности, определяемой по паттерну активации нейронов в сети, было обнаружено увеличение доли нейронов, активирующихся при распространении возбуждения в сети с временем активации не более 100 мс. В результате паттерн активации сетевой активности после добавления в среду BDNF отличался от контрольных значений (рис. 9) даже через сутки после воздействия.

Таким образом, аппликация нейротрофического фактора BDNF (0,1 нг/мл, 1 нг/мл) в раннем периоде развития нейронных сетей на 7 DIV не вызывала активацию спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа, но влияла на перераспределение активации нейронов в составе нейронных сетей культуры диссоциированных клеток гиппокампа.

Эффект длился не менее 1 суток.

Рисунок 8. Влияние нейротрофического фактора BDNF на (А) количество малых сетевых пачек/5 мин; (Б) количество спайков в сетевой пачке; (В) длительность малой cетевой пачки импульсов на 7 день развития культуры in vitro. * - статистически значимые различия с исходным уровнем активности, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Ранее в лаборатории клеточных технологий ЦНИЛ НижГМА было показано, что на 7 DIV в нейронной сети первичнй кулльтуры гиппокампа среди межклеточных контактов преобладают электрические синапсы, химические синаптические контакты единичны (Широкова с соавт., 2013). Поскольку предполагается, что действие нейротрофического фактора на спонтанную биоэлектрическую активность опосредовано влиянием сигнальной системы BDNF/TrkB не только на специфические Na±ионные каналы (Nav1.9) (Rose C.R. et al., 2004), но и на постсинаптические NMDAи GABA-рецепторы, экспрессирующиеся в химических синапсах, нейротропный эффект BDNF на биоэлектрическую активность нейронов не может реализоваться на раннем этапе развития нейронной сети по причине отсутствия полноценных химических синапсов.

Рисунок 9. Паттерн активации спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа в сетевой пачке (DIV 7). Слева — активность культур до аппликации, справа — через 24 часа после аппликации. А — контрольная культура (раствор альбумина в PBS); Б — BDNF, 0,1 нг/мл; В — BDNF, 1нг/мл. Цветовая диаграмма — время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с различных электродов, мс.