Особенности строения кателицидинов и дефензинов

Согласно определению, к ИЗП относятся только генно-кодированные, синтезированные рибосомами полипетидные антимикробные субстанции, которые в длину составляют менее 100 аминокислотных остатков (Ganz and Lehrer 1999). Так как большинство пептидных антибиотиков грибкового и бактериального происхождения являются нерибосомально синтезированными пептидами и содержат атипичные аминокислоты, вышеизложенное определение может служить различительным признаком, позволяющим отделить ИЗП от этой категории. (Ganz and Lehrer 1999). Природные антимикробные вещества многочисленны и по размеру варьируются от относительно больших протеиновых комплексов (напр., каскад комплемента) до малых неорганических молекул (напр., перекись водорода) (Ganz 2005; Ganz and Lehrer 1999). Исходя из молекулярного строения, конформационной структуры или строения пробладающей аминокислоты, ИЗП можно разделить на четыре основных класса: линейные б-спиральные структуры без дисульфидных связей (напрмер, кателицидины, магаинины и цекропины), молекулы со структурой в-листа, которая стабилизируется за счет свойственных ей дисульфидных связей (например, би в-дефензины), с пребладанием одной или более аминокислот с высоким содержанием аргинина, глицина, гистидина, пралина, триптофана или их отдельных комбинаций (напр., индолицидин), и петлевидные пептиды с одной дисульфидной связью (напр., бактенецин) (Koczulla and Bals 2003; Hancock 1997; Andreu and Rivas 1998; van `t Hof et al. 2001; Hancock and Sahl 2006; Zhang and Falla 2009). Биологическое действие ИЗП зависит в первую очередь от их третичной структуры, соответственно, особенности их строения вызывают непосредственный интерес (Sima et al. 2003).

Два основных класса традиционных ИЗП человека — это дефензины и кателицидины. Классические молекулы дефензина включают группу малых амфифильных, иногда с высоким содержанием аргинина, катионных пептидов, которые, как правило, состоят из 29−45 аминокислотных остатков. Различают би в-дефензины; дисульфидные связи б-дефензинов — это Cys1-Cys6, Cys2-Cys4 и Cys3-Cys5 (цифра указывает позицию цистеинового остатка в аминокислотной последовательности относительно N-конца), в то время как для в-дефензинов это Cys1-Cys5, Cys2-Cys4 и Cys3-Cys6 (Oppenheim et al. 2003; Ganz 2005; Matzinger 2007; Kesting et al. 2009). В нейтрофилах человека, дефензины содержат 30−50% зернистых белков (Oppenheim et al. 2003; Matzinger 2007). Кроме этого, дефензины были также идентифицированы в клетках других типов, в том числе в тканевых макрофагах, мелких клетках кишечного эпителия и кардиомицетах (Linde et al. 2007; Scott et al. 2002; Steinstraesser et al. 2008; Wah et al. 2006). В коже человека дефензины продуцируются в основном кератиноцитами, нейтрофилами, потовыми и сальными железами (Koczulla and Bals 2003) и могут выделяться как в обычных условиях, так в ответ на воспалительный стимул. В целом, строение молекулы дефензиновых пептидов сравнивали с изогнутой скрепкой: внутримолекулярные дисульфидные связи между участками с NH2-концом и COOH-концом пептида, создавая цикличную, трижды скрученную, амфифильную структуру в-листа, образуют характерную «дефензиновую» складку и пространственно разделяют гидрофильную и гидрофобную области. Эти три внутримолекулярные дисульфидные связи стабилизируют структуру в-листа и повышают устойчивость к протеолизису, но понижают гибкость молекулы (Campopiano et al. 2004; Maemoto et al. 2004; Wu et al. 2003), хотя дисульфидные мостики неявляются критически необходимыми антимикробной активности дефензинов (Wu et al. 2003).

На сегодняшний день, основываясь на различиях в размерах и структурных особенностях цистеинового звена (вторичная структура), описаны три разные категории дефензинов позвоночных (в дополнение к дефензинам насекомых и растений) (Boman 2003; Zasloff 2002). б-Дефензины представляют собой классические «нейтрофильные дефензины», которые были впервые описаны в середине 1980;х годов, тогда как о более крупных в-дефензинах впервые было упомянуто в начале 1990;х (Ganz and Lehrer 1999). В базе данных Триеста содержатся данные о 90 в-дефензинах и 55 б-дефензинах. Не так давно были описаны более редкие г-дефензины. Среди видов широко распространены би в-Дефензины, а г-дефензины, как известно, определяются только в гранулоцитах макак-резус и некоторых других приматов, в том числе других приматов семейства мартышковых и орангутангов (Crovella et al. 2005; Selsted 2004; Tran et al. 2008). г-Дефензины — это небольшие двухспиральные кольцевидные молекулы, в отличие от би в-дефензинов, которые представляют из себя плоские трижды скрученные в-листы (Boman 2003). Секретируемые нейтрофилами альфа-дефензины можно обнаружить в биологических жидкостях (Panyutich et al. 1991, 1993, 1994). Концентрация б-дефензинов в плазме человека, соответствующая физиологической норме, составляет 40 нг/мл, методом иммуноферментного анализа (ИФА) (Panyutich et al. 1991). При наличии воспаленительного процесса их концентрация взрастает в 2−4 раза, а при сепсисе достигает микромолярной концентрации (Panyutich et al. 1993). В плазме би в-дефензинынеспецифически связываются с протеинами сыворотки крови с большой молекулярной массой такими, как сывороточный альбумин, б2-макроглобулин и C1 комплемент, который понижает их противовирусную и противоопухолевую активность (Panyutich and Ganz 1991). би в-дефензины определются в жидкостях тела человека во время воспаления легких, инфекций мочевыводящих путей и в слезах после офтальмологических хирургических вмешательств (Chromek et al. 2006; Thompson et al. 2006; Lemaitre et al. 1996).

hCAP-18, обладающий б-спиральным строением, известный также как LL-37, является единственным изученным антимикробным пептидом из семейства кателицидинов, и впервые был описан в 1995. Кателицидины обнаруживаются в разных количествах во множестве видов, в том числе у млекопитающих (Scott and Hancock 2000; Zanetti 2004). Общим признаком кателицидиновых пептидов является хорошо заметное сходство, определяемое как кателиновый домен в 50 зонах и антимикробный домен С-конца, который, при необходимости, может меняться и высвобождается путем протеолиза. (Otte et al. 2009; Tomasinsig and Zanetti 2005). Кателицидины, как правило, экспрессируются миелоидными клетками-предшественниками, но также известно, что у некоторых видов они экспрессируются в зрелых циркулирующих нейтрофилах и лимфоидной ткани новорожденных (Zanetti 2004). Они накапливаются в виде неактивных пропептидов и процессируют только в ответ на стимуляцию, высвобождая в межклеточную жидкость активные ИЗП (Scott et al. 2002; Zanetti 2004). Вырабатываются они преимущественно лейкоцитами и клетками эпителия и слизистой оболочки, где они накапливаются в специфических гранулах (Scott et al. 2002).

Положительно заряженный C-концевой LL-37, состоящий из 37 аминокислот фрагмент, демонстрирует широкий спектр антимикробной активности опосредованной прямым взаимодействием с мембраной микробной клетки и ее разрушением. Ферментом, ответственным за растворение пропротеинов в нейтрофилах является серинпротеиназа 3. Согласно недавним исследованиям, в коже сериновые протеазы калликреин 5 и 7 выполняют роль посредника в альтернативном процессинге hCAP18, генерируя некоторые ранее неизвестные пептидные фрагменты, из чего можно сделать вывод, что тканевой профиль этого пептида может различаться в зависимости от ткани и биологических условий. То, что их функциональный профиль может различаться, открывает новую потенциальную область для исследований. Помимо противомикробной активности, LL-37, предположительно, участвует в различных биологических процессах, таких как ангиогенез, хемотаксис, выработка цитокинов, высвобождение гистамина и заживление ран. (Koczulla and Bals 2003; Jacobsen et al. 2005a, b; Scott et al. 2002; Shaykhiev et al. 2005; Steinstraesser et al. 2006). Кроме того, количество кателицидиновых антимикробных пептидов различно у разных видов, что сколрее всего является причиной разной степени резистентности различных видов к специфическим типам инфекций. (Lee et al. 2005). Было установлено, что у людей ИЗП являются необходимыми молекулами-эффекторами TLRиндуцированного противомикробного ответа на внутриклеточные микобактерии в макрофагах. Выяснение механизмов этих защитных реакций, используемых макрофагами человека в схватке с патогенном, определяет возможные направления для разработки новых терапевтических стратегий (Liu et al. 2009; Nizet et al. 2001). Интересно, что кателицидины и дефензины проявляют синергизм, подразумевающий их объединенную роль в синхронизации работы врожденного иммунитета, о чем будет более подробно сказано далее (Lee et al. 2005).

Иммунозащитные пептиды — синтез, экспрессия и механизм действия ИЗП могут экспрессироваться конститутивно или индуцироваться в ответ на специфический стрессорный фактор, такой как инфекция или воспаление (Sima et al. 2003; Diamond et al. 2000; Hirsch et al. 2008,.

2009). б-Дефензинам более свойственна конститутивная экспрессия, тогда как выработка в-дефензинов чаще индуцируется (Hancock and Scott 2000; Scott and Hancock 2000). Кроме того, было установлено, что б-дензины в основном действуют внутри фагосом, тогда как в-дефензины производятся в основном эпителиальными клетками (Boman 2003). Липополисахарид (ЛПС) и провоспалительный цитокин IL-1b и TNF-б способствуют синтезу ИЗП (Sima et al. 2003). Такая выработка напоминает выработку пептидных гормонов, предполагающую наличие крупной молкулы-предшественника и тканеспецифического последовательного протеолитического процессинга (Ganz 2005). После удаления сигнальной последовательности, прорегион устранняется, оставляя активные ИЗП. (Scott and Hancock 2000). Молекулы дефензинов продуцируются как нейтральные препродефензины, которые состоят из, приблизительно, 95 аминокислот, нецитотоксичных по отношению к клетке (Ganz 2005). Предполагается, что антимикробные и цитотоксические функциональные свойства зрелых дефензинов и других ИЗП в основном ассоциируются с наличием у них, как у мультимеров, способности образовывать поры в мембранах, ведущие к самопроизвольной диффузии (Ganz 2005; Scott and Hancock 2000), механизм был описан моделью Shia-Matsuzaki-Huang (Matsuzaki 1999; Shai 1999; Yang et al. 2000).

Противомикробные свойства ИЗП как мембранных агентов, обладающих вторичной б-спиральной пептидной структурой, зависит от наличия ионной среды, сходной с физиологическими жидкостями млекопитающих (Dorschner et al. 2006; Johansson et al. 1998; Oren et al. 1999). ИЗП нацелено определяют самое слабое место микробной цитоплазматической мембраны (например, отсутствие холестерина и негативно заряженные фосфолипиды на внешнем листе цитоплазматической мембраны) (Zasloff 2002). Суммарный позитивный заряд (от + 2 до + 7 вследствие избытка основных аминокислот по сравнению с кислыми аминокислотами) (Scott and Hancock 2000) облегчает связывание возрастающего количества ИЗП с фосфолипидами на поверхности бактерии до полного разрушения бактериальной мембраны. (Boman 2003; Hale and Hancock 2007; Sallum and Chen 2008; Steiner et al. 1988).

Холестерин предотвращает повреждение мембраны, и так как он является неотъемлемой частью эукариотической мембраны, то, становится ясно, почему нормальная концентрация ИЗП не приводит к повреждению клеток организма-хозяина (Boman 2003). Мембранный потенциал эукариотических клеток (?15 мВ) также ниже трансмембранного потенциала бактерий (?140 mV), что уменьшает вероятность взаимодействия (Scott and Hancock 2000). Резистентность к ИЗП — редкое явление, и любому микроорганизму особенно трудно изменить свою структурную организацию поверхностных фосфолипидов (Zasloff 2002). Некоторые ИЗП, помимо разрашуения бактериальной мембраны, также нацелены на внутреннеее содержимое (Jenssen et al. 2006; Xiong et al. 1999).

Хотя многие ИЗП, например, дефензины, демонстрируют прямую антимикробную активность против бактерий, грибков, эукариотических паразитов и/или вирусов (Steinstraesser et al. 2005, 2008; Hirsch et al. 2008; Larrick et al. 1995), также было установлено, что многие из них играют ключевую модулирующую роль во врожденном иммунном ответе, и представляют важное связующее звено между врожденным и адаптивным иммунным ответом (Zasloff 2002).

Различные ткани и виды клеток в организме содержат генно-закодированные образораспознающие рецепторы (ОРР) и могут задействовать ряд разных сигнальных путей в ответ на стресс, в конечном счете, обеспечивая выработку всех сигнальных и эффекторных молекул, необходимых для соответствующей и немедленной иммунной защиты. ООР организма — это, как правило, поверхностные белки, которые незамедлительно определяют консервативную молекулярную структуру, связанную с патогенными микроорганизмами или иной предстоящей опасностью. Репертуар ООР, способных регулировать экспрессию гена, включает TLR и обнаруживающие вирусы RIG-I и Mda5 геликазы (Onomoto et al. 2007; Yoneyama et al. 2005; Zou et al. 2009; Robinson et al. 2006). Однако, были описаны и другие распознающие молекулы, не относящиеся к TLR. Структуры, распознанные данным ООР, классифицируются или как участки молекул, связанные с патогенами (PAMP), или как участки молекул, связанные с опасностями (DAMP). К классическим PAMP относятся липосахариды и липотейхоевая кислота (LTA) из грамотрицательных и из грамположительных бактерий, соответственно, вирусная двухспиральная РНК (дсРНК), и грибковые b-глюканы (Robinson et al. 2006; Jo 2008). Понятие DAMP тут используется как общее название для PAMP и эндогенных сигналов опасности, испускаемых умирающими или поврежденными клетками (Matzinger 2007; Seong and Matzinger 2004). Модель опасности Метцингер определяет «опасность» как что-либо (экзогенное или эндогенное), способное вызвать стресс тканей или их разрушение (Matzinger 1994, 2007). Также к врожденным рецепторам относятся внутриклеточные nod-подобные рецепторы (NLR), которые представляют собой мощную комбинированную защиту в клеточной мембране (например, TLR, а также и в самой клетке (например, NLR) (Benko et al. 2008; Fritz et al. 2006). И TLR, и Nodg белки могут запустить транскрипционный фактор ядерного фактора-kB (NF-KB), таким образом активируя чрезвычайно стереотипный сингальный путь, отвечающий за ряд различных клеточных ответов, в том числе выработку ИЗП (Fritz et al. 2006). NLR были связаны с распознаванием бактериальных компонентов, а также эндогенных сигналов опасности (Fritz et al. 2006). TLR изначально вызвали значительный интерес у исследователей, в результате чего эта группа ООР описана лучше всего: сообщалось о почти 20 представителях в шести основных семействах, каждый представитель признавался отдельным PAMP. Липосахарид — классический лиганд для TLR-4, где олигодезоксинуклеотиды LTA и CpG распознаются TLR-2 и TLR-9, соответственно (Dalpke et al.2005). Сигнальный NF-kB — один из главных низлежащих путей, отвечающих за выработку ИЗП, хотя другие сигнальные пути (в том числе MAPKh и JAK/STATi) вовлечены в их синтез (Ji et al. 2009; Krisanaprakornkit et al. 2002). NF-kB — транскрипционный фактор, участвующий в объединении многочисленных параллельных сигнальных путей и множества клеточных ответов в основную немедленную и эффективную иммунную реакцию, а также выработке цитокинов и молекул неспецифической адгезии клеток (Scott and Hancock 2000). Подача сигнала по этим путям приводит к транскрипционной активации и последующей выработке ИЗП. TLR и NLR также влекут за собой активацию воспалительных каспаз, однако данная область исследований лежит вне предмета данной статьи (Martinon and Tschopp 2007; Scott and Saleh 2007; Steinstrasser et al. 2007).