Введение. 
Лабораторная диагностика вагинитов

Вагиниты (кольпиты) — группа заболеваний, сопровождающихся воспалительными процессами в слизистой оболочке влагалища, полиэтиологической природы. Проявлениями вагинитов служат серозные или гнойные выделения, зуд, боль, жжение, дискомфорт в области половых органов, усиливающиеся во время мочеиспускания. Основной причиной вагинитов является попадание и размножение во влагалище патогенной микрофлоры. Особенно опасны хламидийные, трихомонозные вагиниты, т. к. ведут к нарушению репродуктивной функции. Среди воспалительных заболеваний женской половой системы вагиниты занимают одно из лидирующих мест, и их число неуклонно увеличивается.

Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

Хламидии (Chlamydia trachomatis) являются мелкими грамотрицательными микроорганизмами. Хламидии составляют группу облигатных внутриклеточных паразитов, не могут размножаться вне клетки хозяина. Наибольший тропизм хламидии проявляют к клеткам цилиндрического эпителия. Цикл развития хламидии включает две формы существования микроорганизма: элементарные тельца (ЭТ) — мелкие (0,15 — 0,2 мкм) неподвижные сферические организмы и ретикулярные (инициальные) тельца (РТ) — более крупные (около 1 мкм). ЭТ представляет собой высоко инфекционную форму возбудителя, адаптированную к внеклеточному существованию. ЭТ адсорбируется на поверхность эпителиальной клетки при помощи специфического поверхностного термолабильного эффектора, структурно связанного с типоспецифическим хламидийным антигеном и комплементарного клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту. Последняя разрушается нейраминидазой и ЭТ проникает в клетку. Хламидии не имеют активного механизма проникновения в чувствительную клетку. Проникновение ЭТ осуществляется посредством фагоцитарной активности клеток, при этом происходит ингибирование процесса слияния фагосомы, в которой они находятся, с лизосомами и тем самым «выключают» важнейший защитный клеточный механизм.

В клетке начинается процесс деления ЭТ: увеличивается количество рибосом и полирибосом, визуализируется бактериальный нуклеоид, они увеличиваются в размере, появляются формы бинарного деления, формируется РТ, которое далее распадается на ЭТ. Из одного ЭТ образуется от 200 до 1000 новых «инфекционных единиц», новых ЭТ. Обычно этот процесс длится 18 — 24 часа. Все это время возбудитель персистирует в фагосоме пораженной клетки. Вновь образовавшиеся ЭТ покидают клетку хозяина при ее разрушении, либо путем экзоцитоза, окруженные тонким ободком цитоплазмы. В последнем случае жизнеспособность клетки сохраняется. Предполагается, что данный механизм высвобождения ЭТ является одним из факторов бессимптомного и латентного течения хламидийной инфекции.

Вновь образовавшиеся ЭТ после выхода из пораженной клетки могут инфицировать новые здоровые клетки, что приводит к прогрессированию инфекционного процесса. Длительность инкубационного периода зависит от состояния организма, инфицирующей дозы, локуса поражения и может составлять в среднем от 14 до 35 дней.

В настоящее время различают по антигенной структуре 15 серотипов патогенных штаммов С. trachomatis. Так называемые «глазные» штаммы по эпидемическим особенностям и клиническим проявлениям хламидийной инфекции отличаются от «генитальных» штаммов. Первые (4 серовара С. trachomatis: А, В, Ва, С) вызывают классическую эндемическую трахому, передаются из глаз больного в глаза здорового контактным путем. Вторые (серовары от D до К) поражают отделы урогенитального тракта и передаются половым путем. Возможно инфицирование глаз «генитальными» штаммами хламидий у взрослых и детей при заносе инфицированного материала руками, полотенцами и другими бытовыми предметами, при купании, особенно в бассейнах, а также у новорожденных во время родов при прохождении через родовые пути инфицированной матери.

С.trachomatis различных серотипов имеют общий групповой, родоспецифический антиген — липополисахаридный комплекс, в состав которого входит 2-кето-3-дезоксиоктановая кислота. Данная антигенная особенность позволяет определять хламидийный антиген группоспецифической сывороткой.

Лабораторная диагностика

Диагноз урогенитального хламидиоза основывается на данных анамнеза, клинической картине и подтверждается результатами лабораторных исследований. Результаты лабораторных исследований в процессе лечения позволяют оценить адекватность проводимой терапии, а по окончанию ее оценить полноту излечения.

Диагностическая значимость результатов лабораторных исследований зависит от следующих факторов:

• 1. Выбор соответствующего метода лабораторного исследования;
• 2. Правильная подготовка пациента к исследованию;
• 3. Правильное взятие врачом-клиницистом биоматериала для исследования из соответствующих очагов поражения;
• 4. Правильная предварительная подготовка биоматериала и своевременное проведение исследования;
• 5. Материально-техническое обеспечение лабораторного исследования;
• 6. Уровень квалификации медицинского персонала, проводящего исследование.

Для диагностики хламидийной инфекции используют 4-е группы методов:

• 1. Культуральный метод;
• 2. Цитологический метод;
• 3. Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции;
• 4. Методы, использующие принципы молекулярной биологии.

Культуральный метод

Культивирование С. trahomatis на перевиваемых линиях клеток млекопитающих, либо в клетках желточных мешочков куриных эмбрионов с последующей их идентификацией, является самым специфичным и наиболее чувствительным методом лабораторной диагностики хламидиоза. Культуральный метод считается «золотым стандартом», с которым сравнивают специфичность и чувствительность всех других методов лабораторной диагностики. Для диагностики хламидиоза культуральным методом нужна специальная лаборатория, оборудованная всем необходимым для работы с культурами тканей и перевиваемыми линиями клеток, специально подготовленный высококвалифицированный медперсонал. Метод трудоемкий, требует значительного времени для получения окончательного ответа (от 3 до 14 дней и более при проведении нескольких пассажей). Поэтому до настоящего времени культуральный метод диагностики урогенитального хламидиоза не получил широкого распространения в практической лабораторной диагностике и используется в основном для научных целей, а также для сравнительной оценки специфичности и чувствительности других методов диагностики хламидиоза.

Цитологический метод Цитологический метод лабораторной диагностики наиболее простой и доступный. Данный метод дает общее представление о цитологической картине, морфологии клеток из очага поражения, наличии микробного обсеменения, мицелия грибковой флоры и простейших. Специфические морфологические признаки позволяют определить наличие хламидий в препарате.

Препарат фиксируют метиловым спиртом (5 мин), либо 96% этиловым спиртом (5 мин), либо смесью Никифорова (1 часть этилового спирта и 2 части этилового спирта — 5 мин), либо охлажденным безводным ацетоном (3 — 5 мин).

После фиксации высушенные мазки окрашивают по Романовскому-Гимзе или по Маккиавело.

Окраска по Романовскому-Гимзе: краску Романовского-Гимзе разводят в соотношении 1:10 фосфатным буфером с рН 7.2 — 7.6 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера) и наносят на мазок на 1 — 2 часа, далее препарат промывают под проточной водой, прополаскивают дистиллированной водой, дифференцируют, погружая на 1 — 3 секунды в 96% этиловый спирт, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900 — 1500 раз (ок. 10−15, об. 90−100).

При микроскопии ЭТ хламидий представляют собой мелкие (0.15 — 0.3 мкм) образования округлой формы, окрашенные в розовый или красноватый цвет. Они могут находиться как внеклеточно (преимущественно), так и внутриклеточно. Более крупные РТ (0.5 — 1.5 мкм) окрашиваются в различные оттенки от голубого до темно-синего цвета и находятся внутриклеточно, при микроскопическом исследовании они обнаруживаются в виде скоплений вокруг ядра эпителиальной клетки в форме «шапочки жандарма» или диффузно.

Ядра клеток при данной окраски имеют вишневый оттенок различной интенсивности, а цитоплазма прокрашивается в нежно-голубой цвет.

Окраска по Маккиавелло: мазок-отпечаток на предметном стекле фиксируют над пламенем горелки несколько секунд и далее окрашивают 0.25% раствором основного фуксина в течение 5 минут. Затем краску смывают под проточной водой. Препарат помещают на несколько секунд в 0.5% раствор лимонной кислоты и затем промывают под проточной водой. Последний этап — дополнительное окрашивание 1% раствором метиленового синего в течение 20 — 30 сек, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900 — 1500 раз.

Ядра клеток окрашиваются в бледно-розовый цвет, цитоплазма — в нежно-голубой. РТ (внутриклеточные) окрашиваются в различные оттенки голубого цвета (от светлого до темного), ЭТ имеют красноватый цвет и могут находиться как внутриклеточно, так и внеклеточно (преимущественно).

Цитологические методы просты в выполнении, дешевые, не требуют сложного оборудования, больших временных затрат, специальной подготовки и дополнительных навыков у лаборантов и врачей-лаборантов, владеющих техникой световой микроскопии. Однако их диагностическая значимость очень низкая: у больных мужчин диагностировать хламидийную инфекцию цитологическим методом в соскобах из уретры удается лишь в 10 — 15% случаев, а у женщин — до 30 — 40% случаев (в соскобах из цервикального канала).

В тоже время цитологический метод позволяет выявить неспецифические морфологические изменения эпителиальных клеток, которые могут косвенно свидетельствовать о наличии поражения урогенитального тракта, в том числе и хламидийной этиологии. Нормальные эпителиальные клетки имеют круглое ядро диаметром 10 — 15 мкм, цитоплазма при окраске по Романовскому-Гимзе прокрашивается в голубой цвет, хроматин — в пурпурный. Сама клетка — округлой формы, диаметр ее достигает 20 — 25 мкм. В соскобах у больных с хламидийной урогенитальной инфекцией могут быть следующие морфологические изменения эпителиальных клеток: клетки увеличены в размере, диаметром до 30 мкм и более, цитоплазма их нередко вакуолизирована, может иметь включения различного размера — от 0.3 до 0.5 мкм и более. Иногда можно наблюдать клетки с явлениями фагоцитоза. В клетках происходит изменение морфологии ядра: отмечается полиморфизм, макронуклеоз — увеличение ядра до 15 мкм и более, полинуклеоз (2 и более ядер в клетке). В соскобах также могут встречаться лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, плазмоциты и мононуклеарные клетки. Выраженность морфологических изменений часто коррелирует с выраженностью патологического процесса.

Описанные клеточные изменения могут служить косвенным признаком хламидийной инфекции. Цитологический метод пригоден для проведения массовых и первичных обследований урологических и гинекологических больных с последующим обследованием их более специфическими и диагностически значимыми методами при получении патологических или сомнительных результатов.