Методы обследования и лечения больных с врожденной косолапостью

Биохимические методы обследования больных с врожденной косолапостью

В последние годы появляется все больше исследований, рассматривающих врожденную косолапость, как проявление системного поражения соединительной ткани [43, 52,62, 107. 114, 124, 144, 175, 177]. Соединительная ткань характеризуется избытком внеклеточного матрикса, основу его составляют протеогликаны, усиленные волокнами 3-х типов: 1. коллагеновыми (коллаген I типа); 2. гибкими (эластин, фибриллин); 3. сетчатыми (коллаген III типа).

В образовании компонентов соединительной ткани принимает участие магний зависимые ферменты. Дефицит магния усиливает диспластические процессы в соединительной ткани, нарушая ее прочность. Взаимосвязь между дефицитом магния и диспластическими процессами в соединительной ткани особенно проявляется у детей в период активного роста: 1 год жизни; период подготовки к школе (5−7 лет); период подросткового рывка (11−15 лет).

Не исключено, что высокий процент рецидивов косолапости связан с патологией образования коллагена, неправильным соотношением коллагена I, II типов и высокому уровню металлопротеиназ IX типа.

Как известно, клетки крови и кроветворная ткань эмбриологически имеют мезенхимное происхождение и являются разновидностью соединительной ткани. При дисплазии соединительной ткани страдает сосудисто-тромбоцитарное, коагуляционное звенья системы гемостаза. Выявляются тромбоцитопатии, снижаются факторы свертывания крови.

Подтверждением наличия выраженных изменений в организме при дисплазии соединительной ткани служат исследования биохимических показателей крови — уровня металлопротеиназ (I, IX) коллагена I типа, магния эритроцитов, фибриногена, щелочной фосфатазы и других.

Щелочная фосфатаза

Щелочная фосфатаза сыворотки состоит из 4 структурных генотипов: печеночно-костно-почечный тип, кишечный тип, плацентарный тип и зародышевый тип, локализующейся в эмбриональных клетках. Щелочная фосфатаза присутствует, а остеобластах, гепатоцитах, в почках, селезенке, плаценте, предстательной железе, лейкоцитах и в тонкой кишке. Печеночнокостно-почечный тип имеет наибольшее значение.

Повышением активности щелочной фосфатазы сопровождаются заболевания костной ткани, такие как болезнь Педжета, гиперпаратироидизм, рахит и остеомаляция, а также переломы костей и злокачественные опухоли. Активность щелочной фосфатазы повышается при всех формах холестаза, особенно при обтурационной желтухе. Также существенное повышение активности щелочной фосфатазы иногда наблюдают у детей и подростков. Оно вызвано усилением активности остеобластов при ускоренном росте и формировании скелета. Поэтому для клинической оценки результатов определения активности щелочной фосфатазы необходимо учитывать возрастные особенности.

В 1946 году Беосей, Лоури и Брок опубликовали метод определения активности щелочной фосфатазы с использованием р-нитрофенил фосфата в качестве субстрата в глициновом/NaOH буфере. В 1967 году метод был усовершенствован Хаусаменом и др., предложившими использовать диэтаноламиновый буфер. Стандартный оптимизированный метод, описанный здесь, с 1972 года рекомендован Германским Обществом клинической химии (DGKC). [141].

Принцип теста:

Калориметрический анализ в соответствии со стандартной методикой.

В присутствии магния и ионов цинка р-нитрофенилфосфат гидролизуется фосфатазой до фосфата и р-нитрофенола. Количество освобожденного окрашенного р-нитрофенола пропорционально активности щелочной фосфатазы и может быть измерено фотометрически. [110, 129, 133, 137, 139, 141, 173].

Фибриноген

Количественный анализ фибриногена по методу Клаусса Количественное определение фибриногена является базисным тестом исследования гемостаза. Тест проводится при гиперфибриногенемиях, связанных с тяжестью воспалительных, иммунных, деструктивных процессов, с риском развития гипервискозного синдрома, артериальных тромбозов и инфарктов органов. Снижение концентрации фибриногена наблюдается при остром ДВС-синдроме, при лечении фибринолитиками, при врожденных гипои дисфибриногенемиях.

Фактор I свертывания крови — фибриноген (Mw-340 ООО D) — является гликопротеином и находится в растворенном состоянии в плазме крови и в тканях всех позвоночных животных. Образование фибрина и его стабилизация представляют собой финальный этап формирования тромба, при котором растворимый фибриноген превращается в нерастворимый фибрин под действием тромбина и фактора XIII.

Фибриноген синтезируется в печени и имеет много функций: принимает участие как в свертывании крови, так и в агрегации тромбоцитов, определяет вязкость крови и влияет на взаимодействие форменных элементов крови с сосудистой стенкой.

Разработаны различные методы определения фибриногена: кинетический, весовой, коагулометрический и др.

Метод Клаусса был предложен автором в 1957 г. [118].

Принцип метода основан на особенностях кинетики реакции фибриногентромбин, когда исследуемую плазму крови разбавляют в 10 раз с целью снижения влияния ингибиторов тромбина (антитромбина III и др.). В этих условиях при высоких концентрациях тромбина и низких концентрациях фибриногена время реакции образования сгустка зависит только от количества фибриногена.

Метод Клаусса очень прост в исполнении, определяет только активный фибриноген, метод точен и стандартен, широко применяется за рубежом.

Нами использовались наборы РЕНАМ для анализа фибриногена [46, 47].

Растворимые фибринмонорные комплексы

Растворимые фибринмономерные комплексы (РФМК) — это частицы тромбов, которые в большом количестве появляются в крови при развитии массивных тромбозов, например, тромбоэмболии легочной артерии, тромбоза других крупных артерий и вен. Кроме того, высокие концентрации РФМК обнаруживаются в плазме больных с ДВС-синдромом (резкое нарушение всех процессов свертывания крови, которое наблюдается при многих критических состояниях).

Используемые нами наборы НПО «РЕНАМ» предназначен для экспрессоценки содержания растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК) в плазме крови.

Метод имеет большое диагностическое значение, так как является маркером тромбинемии как одного из основных признаков диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдрома), а также тромбозов и эмболий. В отличие от широко используемых этанолового и протамин-сульфатного тестов о-фенантролиновый тест наиболее информативен и стандартизован. Он позволяет проводить динамический контроль за содержанием РФМК в плазме, в том числе в процессе лечения.

Принцип метода.

Тест основан на оценке времени появления в исследуемой плазме хлопьев фибрина после добавления в нее о-фенантролина. Скорость их образования зависит от концентрации РФМК [48].

Матриксная металлопротеиназа 1.

Матриксные металлопротеиназы (ММР), также называемые матриксины, составляют семейство цинки кальций-зависимых эндопептидаз; их функция — расщепление почти всех основных белковых компонентов внеклеточного матрикса (ECM). Они играют важную роль во многих нормальных физиологических процессах, таких, как эмбриональное развитие, морфогенез, репродукция и тканевое ремоделирование. Они также участвуют во многих патологических процессах, таких, как воспаление и заживление ран, артрит, рак и сердечно-сосудистые заболевания. В то время как, количество вновь синтезированных MMPs регулируется в основном на уровне транскрипции, протеолитическая активность существующих ММРs контролируется как активацией проферментов разнообразными протеиназами или органическими ртуть-содержащими соединениями, так и ингибированием активных ферментов эндогенными ингибиторами, б2-макроглобулином и тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMPs), а также хелаторами металлов: фенантролином и ЭДТА. MMP-1 (также известная как интестинальная коллагеназа, коллагеназа позвоночных, коллагеназа фибробластов и коллагеназа I синтезируется фибробластами, хондроцитами, макрофагами, кератиноцитами, эндотелиальными клетками и остеобластами. Синтез MMP-1 стимулируется разными агентами, включая цитокины, например, EGF (эпителиальный фактор роста), интерлейкины и TNF-б, химические соединения (цАМФ и эфиры форбола), а также процессы, протекающие на клеточной мембране, например, слияние клеток и фагоцитоз. MMP-1 ингибируется стехиометрически TIMP-1 и TIMP-2 и быстро ингибируется б2-макроглобулином. Структурно последовательность аминокислотных остатков MMP-1 длиной в 450 аа состоит из N-терминального продомена (80 аа), который отщепляется во время активации, и каталитического домена (162 аа) содержащего цинк-связывающий участок, связывающий-пептид (16 аа) и C-терминальный гемопексин-подобный домен (192 аа). MMP-1 принимает участие в деградации коллагеновых нитей в процессе ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса, для которой характерно расщепление тройной спирали интестинального коллагена на фрагменты величиной ѕ и ј от начальной. Таким образом, MMP-1 вовлечен в широкий круг биологических процессов, в которых происходит деградация коллагена. Сюда входят ревматоидный артрит, остеоартрит, заболевания периодонта, опухолевая инвазия, ангиогенез, изъязвление роговицы, тканевое ремоделирование, воспалительные заболевания кишечника, атеросклероз, аневризма и рестеноз. К тому же, MMP-1 может также расщеплять другие субстраты: казеин, желатин, аггрекан, энтактин, проФНО и связывающий белок хряща. Таким образом, роль MMP-1 более разнообразна, чем это предполагалось сначала, и возможно, она вовлечена в ферментные каскады, цитокиновую регуляцию и модуляцию клеточной мембраны.

Нами использовался набор Human MMP-1 ELISA (For Lysates), который предназначен для количественного определения человеческой матриксной металлопротеиназы 1 в образцах лизатов клеток и тканей методом иммуноферментного анализа. Диапазон измерения: 8−18 000 пг/мл. Аналитическая чувствительность: 8 пг/мл [64].

Матриксная металлопротеиназа 9.

Матриксные металлопротеиназы (ММРs), также называемые матриксины, составляют семейство цинки кальций-зависимых эндопептидаз, их функция — расщепление почти всех основных белковых компонентов внеклеточного матрикса (ECM). Они секретируются в виде зимогенов (про-MMPs), которые активируются различными протеиназами или в реакции с органической ртутью. Их ингибируют специфические тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMPs) и б2-макроглобулин. Регуляция активности MMP очень важна в процессах ремоделирования ткани, при воспалении, злокачественном росте и метастазировании. Человеческая MMP-9 (также известная как желатиназа B) секретируется в виде зимогена м.м. 92 кДа. Расщепление про-MMP-9 по (или рядом) аминокислотному остатку 87 приводит к образованию активного фермента с м.м. приблизительно 82 кДа. MMP-9 содержит три фибронектин II типа-подобных домена, гемопексин-подобный домен и богатый пролином домен, гомологичный коллагену V типа. Про-MMP-9 может быть активирована MMP-3 или различными бактериальными протеиназами. MMP-9 ингибируется б2-макроглобулином или TIMP-1, который связывается и с про-MMP-9 и с активной MMP-9. Обработка про-MMP-9 4-аминофенилртути ацетатом (АРМА) in vitro дает не только активный фермент м.м. 82 кДа, но и С-концевую усеченную форму м.м. приблизительно 65 кДа с активностью, сравнимой с формой 82 кДа. Про-MMP-9 секретируется моноцитам, и макрофагами, нейтрофилами, кератиноцитами, фибробластами, остеокластами, хондроцитами, сателлитными клетками скелетных мышц, эндотелиальными клетками и клетками различных опухолей. Экспрессия про-MMP-9 усиливается под воздействием TGF-в1, IL-1 В, TGF-б, PDGF-AB, TNF-б и IL-1б. Субстратами для MMP-9 являются в том числе денатурированный коллаген I типа (желатин), а также нативные коллагены типов IV, V, VII, X и XI, фибронектин, витронектин, IL-1 В и энтактин, молекула которого соединяет ламинин и коллаген IVтипа. MMP-9 участвует в процессах воспаления, ремоделирования ткани, заживления ран, мобилизации матрикс-связанных факторов роста и процессинге цитокинов. Его экспрессия коррелирует с десмоплазией (нарушение ориентации коллагена), сопровождающей рак поджелудочной железы, с метастазированием в лимфатические узлы у пациенток с раком молочной железы и с инвазией регионарных сосудов при гигантоклеточном раке кости. Уровень MMP-9 может быть повышен в десневой жидкости и слюне у пациентов с заболеваниями десен и периодонта.

Для определения использовался набор Human MMP-9 Quantikine ELISA Kit. Он предназначен для количественного определения человеческой матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9) в образцах супернатантов клеточных культур, сыворотки, плазмы крови, мочи и слюны методом иммуноферментного анализа. Набор Quantikine определяет как профермент, так и активную форму (pro-MMP-9 92 кДа, активную форму MMP-9 82 кДа, но не MMP-9 65 кДа) человеческой ММР-9. Диапазон измерения: 0.06−10 нг/мл. Аналитическая чувствительность: 0.06 нг/мл [65].

С-терминальный телопептид коллаген 1 типа (Cross Laps).

Коллаген типа I составляет более 90% органического матрикса кости и синтезируется непосредственно в костях. Костный матрикс подвергается постоянному обновлению. В ходе синтеза основного белка матрикса — коллагена I типа сначала образуются аминокислотные цепи (б1 и б 2), которые, объединяясь в соотношении 2:1, формируют трехспиральную структуру молекул проколлагена. Проколлаген секретируется во внеклеточную среду: здесь от него отщепляются концевые пропептиды, а образовавшийся при этом еще незрелый коллаген включается в построение фибрилл. Созревание коллагена происходит в результате ряда модификаций его молекул в составе фибрилл и их соединения поперечными пиридинолиновыми сшивками. Во время обновления костной ткани коллаген I типа деградирует, небольшие пептидные фрагменты попадают в кровь и выделяются почками. Отщепление С-телопептидов происходит на самом начальном этапе деградации коллагена, поэтому метаболиты коллагена не влияют на концентрацию С-телопептидов. Основными продуктами деградации С-телопептидов коллагена I типа, экскретируемыми с мочой, являются структуры, известные как CrossLaps, которые состоят из двух октапептидов (8АА), связанных пиридиновой или пиролловой поперечной сшивкой. Во вновь сформированной кости последовательности 8АА содержат б-аспарагиновую кислоту, но по мере старения кости эта кислота изомеризуется в в-форму (т.е. степень изомеризации пропорциональна возрасту кости). Эти фрагменты могут быть определены данным набором. Ранее сообщалось о возможности определять продукты деградации коллагена как в моче, так и в сыворотке конкурентным методом CrossLapsTM ЕLISA, позднее было описано применение сэндвич-анализа. Доказано, что маркеры CrossLapsTM можно использовать при терапии препаратами, снижающими резорбцию костей, у пациентов с болезнями, связанными с нарушениями метаболизма костной ткани. Набор можно использовать с целью оценки степени резорбции костной ткани человека в следующих ситуациях: А. Наблюдение изменения резорбции кости при 1.) Антирезорбционной терапии у женщин в постменопаузе — a) Гормонозаместительная терапия, b) Терапия бифосфонатами; 2.) Антирезорбционной терапии у лиц с диагностированной остеопенией — a) Гормонозаместительная терапия b) Терапия бифосфонатами B. Прогноз восстановления скелетной массы (минеральной плотности костей) у женщин, прошедших курс антирезорбционной терапии (гормонозаместительная терапия, либо терапия бифосфонатами). Преимущество использования CrossLaps состоит в том, что данный маркер костной резорбции позволяет быстро оценить эффективность всех видов терапии остеопороза уже через 3 месяца после начала лечения. Увеличение концентрации CrossLaps на 2 SD от нормы ассоциируется с 2-кратным увеличением риска переломов шейки бедра. Более того, женщины с низким значением минеральной плотности кости шейки бедра (>2,5 SD от среднего уровня лиц молодого возраста) и повышением уровня CrossLaps имеют более высокий риск переломов шейки бедра, чем женщины с одним из факторов риска.

Использованный нами набор Serum CrossLaps® ELISA предназначен для количественного определения С-концевых телопептидов, образующихся при деградации коллагена I, в образцах человеческой сыворотки и плазмы методом иммуноферментного анализа. Диапазон измерения: 0.020−2.494 нг/мл CrossLapsTM. Чувствительность: 0.020 нг/мл CrossLapsTM. Специфичность: набор Serum CrossLaps™ ELISA основан на использовании двух высоко специфичных моноклональных антител к аминокислотной последовательности EKAHD-в-GGR, где остаток аспарагиновой кислоты в-изомеризован. Чтобы получить специфический сигнал в системе Serum CrossLapsTM ELISA, две цепи EKAHD-в-GGR должны быть перекрестно связаны (CrossLaps-антиген) [176].

Агрегация тромбоцитов: спонтанная, с коллагеном, АДФ, ристоцетином (ристомицин) Агрегация тромбоцитов — показатель в оценке нарушений в сосудисто-тромбоцитарной фазе гемостаза.

После повреждения сосуда тромбоциты скапливаются в месте повреждения, возникает реакция, завершающаяся активацией фосфолипазы. В результате мембрана клетки изменяет свойства и может вступать в контакт с соседними клетками. Вследствие этого тромбоциты могут агрегировать друг с другом и образовывать тромбоцитарный тромб.

Наиболее распространенные способы оценки агрегации тромбоцитов заключаются в исследовании скорости и степени уменьшения оптической плотности (увеличения светопропускающей способности) тромбоцитарной плазмы при перемешивании с индукторами агрегации (при изучении спонтанной агрегации они не добавляются) [68].

Для диагностически подавляющего большинства наследственных и приобретенных тромбоцитопатий достаточно исследования функциональных параметров тромбоцитов с использованием трех агонистов. Ими являются индукторы коллаген, ристоцетин и АДФ, входящие в набор АГРенам, предлагаемый НПО РЕНАМ [7].

• 1. Аденозин-5'-дифосфат динатриевая соль (АДФ), лиофильновысу-шенная с буфером и стабилизаторами из раствора с концентрацией.0.2 мМ/литр.
• 2. Коллаген из кожи теленка, выделенный методом кислотной экстракции, растворимый, тип III, лиофильновысушенный с буфером и стабилизаторами из раствора с концентрацией 0.2%.
• 3. Ристоцетин, гликопептидный антибиотик, выделенный из Nocardia lurida с молекулярной массой около 4 кД, лиофильновысушенный с буфером и стабилизаторами из раствора с концентрацией 1.5%.

Состав набора реагентов агренам:

• 0.2 мМ раствор АДФ (0.5 мл) -1 флакон;
• 0.2% раствор коллагена (0.5 мл) — 1 флакон;
• 1.5% раствор ристоцетина (0.5 мл) -1 флакон.

Все исследования проводятся в пластиковых пробирках или в стеклянных силиконизированных.

Определение результатов производилось при помощи двухканального агрегометра SOLAR AP 2110.

Магний эритроцитов Магний — один из основных биологически активных элементов, необходимых для нормального функционирования нервной и мышечной систем.

Магний, как и калий, содержится преимущественно внутри клеток — в эритроцитах, мышцах, печени и других тканях. 1/3 — ½ всего магния организма содержится в костной ткани. Около 1% от всего количества магния организма находится во внеклеточной жидкости и плазме (в связанной с белками, комплексированной с неорганическими анионами и свободной форме). Его ионы являются активаторами большого числа ферментных систем, поэтому многие процессы жизнедеятельности клеток являются магний-зависимыми. Магний участвует в гликолизе, окислительном метаболизме, переносе натрия, калия и кальция через мембраны клеток и нервно-мышечной передаче импульсов, синтезе нуклеиновых кислот и других процессах. Уровень магния в сыворотке может сохраняться в нормальных границах, даже при снижении общего количества магния в организме на 80% [58].

Концентрация магния в эритроцитах определялась по цветной реакции с титановым желтым.

Принцип метода. Магний в щелочной среде образует комплекс красного цвета с титановым желтым, присутствие гидроксиламина стабилизирует окраску. При анализе сыворотки или эритроцитов белки осаждают вольфраматом натрия, моча предварительно разводится до нужной концентрации.

Используемые реактивы.

• 1. 0,075%-ный раствор титанового желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл воды, хранят в холодильнике в темной склянке (реактив очень светочувствителен, годен не более 10 дней).
• 2. 2%-ный раствор гидрохлорида гидроксиламина: 2 г гидроксиламинагидрохлорида (H2NOH ґ HCl) растворяют в 100 мл воды.
• 3. 0,1%-ный раствор метилового красного в 95%-ном этиловом спирте (индикатор с зоной перехода рН 4,4—6,2).
• 4. 0,2 н NaOH.
• 5. 1,5 н NaOH.
• 6. 10%-ный раствор вольфрамовокислого натрия: 10 г вольфрамата натрия (Na2WO4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.
• 7. 0,67 н серная кислота.
• 8. Калибровочный раствор магния сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния (MgSO4/7H2O) растворяют в воде, объем доводят в мерной колбе до 1 л.

При определении содержания магния в эритроцитах 0,5 мл эритроцитарной взвеси вносят в 2,5 мл воды, через несколько минут, когда взвесь просветлеет (станет лаковой), что свидетельствует о завершении гемолиза, добавляют 1 мл 10%-ного вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н серной кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой, а затем через 10—15 мин центрифугируют или фильтруют. В градуированную пробирку или мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают 2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют каплю индикатора метилового красного и 0,2 н NaOH до установления желтой окраски. После этого прибавляют 1 мл 2%-ного гидрохлорида гидроксиламина, 1 мл 0,075%-ного титанового желтого и 2 мл 1,5 н NaOH и доводят объем водой до 10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 500—560 нм против холостого опыта, в котором вместо эритроцитарной взвеси берут 1 мл воды [75].