Искусственные питательные среды, их классификация, требования к ним

Питательные среды по консистенции делятся на плотные, полужидкие, жидкие. По составу могут быть простыми и сложными.

Простые (основные) среды (МПА, МПБ) используют для выращивания многих микробов. В состав сложных сред входят дополнительные компоненты: сыворотка крови, сахара и др. По целевому назначению: обогащенные, элективные, специальные, дифференциально-диагностические.

Обогащенные среды многие виды бактерий не растут на простых средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т. д.

Элективные (избирательные) для выращивания определенных видов бактерий, например, молоко для молочнокислых бактерий, ЖСА — для стафилококков, среда Кауфмана — для сальмонелл.

Специальные — так называют среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских (фосфатная смесь-сыворотка) — для лептоспир.

Дифференциально-диагностические — позволяют различить бактерии разных видов по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и др.

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия — это температура, время культивирования, значение рН среды, состав питательных сред.

• — Время культивирования находится в прямой зависимости от времени генерации вида бактерий и находится в пределах от 18−20 часов для энтеробатерий, до 3−4 недель для микобактерий.
• — По температуре культивирования все микроорганизмы делят на 3 группы: психроилы (холодолюбивые) способны расти и размножаться при температуре 10−15о; мезофилы — оптимальная температура их роста 30−37о; термофильные — при температуре выше 45о.
• — Значение рН среды культивирования находится в пределах от 6,7. Добавки в питательную среду католита нейтрального с рН 7,5 единиц ускоряет рост всех бактерий.
• — Питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые вещества в легкоусвояемой форме, иметь оптимальную влажность, вязкость. РН, быть изотоничной и по возможности прозрачной.

Для культивирования анаэробов используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты. Для создания условий анаэробиоза питательные среды максимально освобождают от кислорода путем кипячения, а также пропуская через жидкие среды инертные газы или наслаивая на поверхность питательной среды вазелиновое масло.

Среда Вильсона-Блера (железосульфитный агар) для культивирования анаэробов состоит из МПА, к которому добавляют глюкозу, Na 2SO3, FeCl2 (хлорид железа).

Среда Китта-Тароции состоит из МПБ, 0,5% глюкозы, кусочков печени или мясного фарша для адсорбции воздуха, викасола и гимина. Перед посевом среду прогревают на водяной бане 10−15 мин для удаления воздуха и заливают слоем вазелиного масла.

Дисбактериозы. Использование пробиотиков в животноводстве Дисбактериоз у животных — изменение нормальной микрофлоры животного организма, характеризующееся уменьшением количества или полным исчезновением типичных для данной области микробов и появлением атипичных форм. При дисбактериозе резко нарушается основная деятельность нормальной микрофлоры кишок — её антагонистическая активность в отношении патогенных микробов, а также витаминобразующая функция, что способствует снижению резистентности организма. Дисбактериоз часто возникает при нерациональной антибиотикотерапии, вызывающей гибель чувствительной к антибиотикам нормальной микрофлоры и бурное размножение устойчивой к ним флоры, например, грибов — возбудителей кандидамикоза, стафилококков, патогенных типов кишечной палочки и др. Одной из важнейших причин развития дисбактериозов у животных является нарушение в режиме кормления, в частности, вскармливание плотоядным (собаке и кошке) большого количества углеводистой пищи (каши, сухие корма и т. д.). В большинстве случаев дисбактериоз является началом развития массы вторичных проблем со здоровьем таких, как гастрит, гастроэнтерит, гепатит, панкреатит, аллергии, снижение резистентности организма и т. д.

Пробиотики это натуральные, естественные представители нормальной микрофлоры кишечника и окружающей среды, которые не только профилактируют и излечивают заболевания, но еще и влияют на рентабельность разведения животных. Это и увеличение продуктивности (яйценоскость, молокоотдача, привесы живой массы), недопущение крупных затрат на препараты для лечение возникающих заболеваний, увеличение конверсии корма, увеличение сохранности молодняка, избежание негативного воздействия при незначительных погрешностях рациона.

Желудочно-кишечный тракт — основная цель действия пробиотика и так случилось, что это цель номер один для вредоносных микроорганизмов попадающих туда с кормом и питьевой водой.

В ЖКТ животного проходят одни из самых важных в жизни животного процессов: 80% иммунитета располагаются в кишечнике, синтез витаминов и аминокислот, переваривание пищи и усвоение всех необходимых витаминов и минералов из корма, утилизация продуктов обмена.

Использование пробиотика в разведении животных, на данный момент является уже неотъемлемой частью процесса. Особое внимание уделяется выпойке молодняка непосредственно с первых дней жизни. Что способствует формированию здорового и устойчивого к заболеваниям поголовья.

Действие химических и физических факторов на микроорганизмы. Понятие о стерилизации, дезинфекции Влияние температуры. Для каждого вида бактерий имеется определенная оптимальная температура развития, поэтому бактерии делят на 3 физиологические группы: психрофильные, мезофильные, термофильные.

Высокие и низкие температуры по-разному влияют на микробы. При низких температурах микробная клетка переходит в состояние анабиоза, в котором она может существовать длительное время. Низкие температуры приостанавливают гнилостные и бродильные процессы. На этом принципе построено сохранение продуктов в ледниках, холодильниках. В микробиологической практике широко применяется длительное хранение культур микробов, иммуноглобулинов, живых вакцин в высушенном виде из замороженного состояния.

Высокая температура губительно действует на микроорганизмы. Применение высокой температуры является самым распространенным и надежным способом стерилизации — уничтожения микробов и их спор. Существуют разные способы стерилизации при помощи высокой температуры:

Прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелкиданный способ применяется ограниченно, например для стерилизации бактериологических петель.

Кипячение — производят в течение 30−45 мин. Однако данный метод не обеспечивает полной стерилизации, так как споры бактерий и некоторые вирусы, защищенные плазмой крови при этом не погибают.

Стерилизация сухим жаром проводится в сушильном шкафу (сухожаровом шкафу или печи Пастера). Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165−170 0С воздуха. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду: чашки Петри, пробирки, и др. Используют следующие температурные режимы и время выдержки стерилизуемого материала:

• — 160 -165 0С в течение 150 мин.
• — 180 0С в течение 60 мин.

Стерилизация паром под давлением. Это один из наиболее эффективных методов стерилизации, основанный на сильном гидролизующем действии насыщенного пара. Паровой стерилизации подвергают перевязочный материал — бинты, шовный материал, вату, белье, изделия из резины, стекла, некоторых полимерных материалов, питательные среды, лекарственные препараты и т. д.

В микробиологической практике используют следующие режимы и экспозицию:

• — 110−112 0С — 0,5 атм. -среды с углеводами в течение 15 мин.,
• — 120 0С — 1 атм. -перевязочный материал, белье, среды — МПБ, МПА. стеклянная посуда в течение 15−20 мин.,
• — 132−134 0С — 1,5 — 2 атм. — весь инфицированный материал в течение 20−25 мин.

Стерилизация текучим паром — при температуре 1000С применяется в тех случаях, когда материал не выдерживает более высокой температуры (например, питательные среды с витаминами, углеводами, желатином и др.). Стерилизацию проводит в аппарате Коха или в автоклаве при не завинченной крышке и открытом выпускном кране. Метод основан на антибактериальном действии пара в отношении вегетативных клеток. Для полного обеспложивания применяют принцип дробной стерилизации, т. е. стерилизуют материал при 100 0С (или 80−90 0С) в течение 20−30 мин. 3 дня подряд. При этом вегетативные клетки погибают, а споры сохраняются и за сутки прорастают. Последующее двукратное прогревание обеспечивает достаточно надежную стерильность материала.

Тиндализация — это дробная стерилизация материалов при 56−58 С в течение часа 5−6 дней подряд для уничтожения не споровых микроорганизмов. Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови, витамины и др.).

Пастеризация основана на антибактериальном действии температуры в отношении вегетативных клеток, но не бактериальных спор. Применяется для пастеризации пищевых продуктов (пиво, вино, соки, молоко и др.).

Влияние высушивания. Высушивание сопровождается обезвоживанием цитоплазмы и денатурацией белков.

Действие ультрафиолетовых лучей применяется для стерилизации воздуха в микробиологических лабораториях, боксах, операционных, в животноводческих помещениях и т. д. Для этого используют бактерицидные лампы различной мощности. Метод основан на бактерицидном действии УФ — лучей с длиной волны 260−300 мкм. Однако полного освобождения от микробов не происходит.

Ионизирующая радиация (рентгеновские лучи). Механизм действия рентгеновских лучей заключается в повреждении генетического аппарата микробной клетки, что приводит к летальному исходу или возникновению мутаций. Ионизирующую радиацию применяют для уничтожения микробов на инструментах, в перевязочном материале, биопрепаратах — холодная стерилизация.

Влияние ультразвука. Вызывает деполяризацию органоидов микробных клеток и денатурацию составляющих их молекул (в результате местного нагревания).

Действие химических факторов.

Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания, не оказывать какого-либо влияния, стимулировать или подавлять рост. Химические средства, применяемые для обработки помещений, оборудования и различных предметов, обозначают термином — дезинфектанты, а вещества, используемые для обработки живых тканей — антисептики. Дезинфицирующие средства оказывают в используемых концентрациях бактерицидное действие, а антисептики в зависимости от концентрации — бактериостатическое или бактерицидное.

По механизму действия химические вещества можно разделить на несколько групп.

Галогены и галогеносодержащие препараты (препараты йода и хлора) широко применяют как дезинфектанты и антисептики: спиртовой раствор йода, йодинол, хлорная известь, хлорамин, хлоргексидин. Бактерицидное действие галогенов связано с одной стороны, способностью, отщеплять активные галогены — хлор, йод, которые, замещая водородные атомы у атомов азота, денатурируют белки цитоплазмы микроорганизмов, с другой стороны, выделяя атомарный кислород, обладают окисляющими свойствами.

Окислители. Механизм антимикробной активности связан с окислением метаболитов и ферментов микроорганизмов либо денатурацией последних. К окислителям относятся перекиси водорода, гидроперит, перманганат калия.

Кислоты и щелочи. В основе бактерицидного действия кислот и щелочей лежат дегидратация (обезвоживание) микроорганизмов, изменение рН питательной среды, гидролиз коллоидных систем и образование кислотных или щелочных альбуминатов.

Поверхностно-активные вещества или детергенты. К ним относятся жирные кислоты, обычные мыла, многие полимерные соединения (септодор, гермосепт, дюльбаль и др). Используют в качестве дезинфектантов и антисептиков. Эти вещества изменяют заряд клеточной мембраны, нарушают проницаемость и осмотическое равновесие микробной клетки, что приводит к ее гибели.

Спирты (70−80% этанол, 60−70% пропанол) Практический интерес представляет этиловый спирт (С Н ОН). Спирты способны отнимать воду и свертывать белок. Бактерицидное действие спирта проявляется с 3−5% концентрации, наиболее сильное противомикробное действие оказывает 70% спирт. Как антисептики наиболее эффективны при использовании в виде 60−70%. С 70% и выше эффект исчезает, происходит дубление, т. е. отнятие воды из микробной клетки, которая фиксируется на объекте, и добавление воды, клетка восстанавливает жизнеспособность.

Альдегиды (формальдегид, уросал и др.) вызывают денатурацию белков. Формальдегид убивает как вегетативные формы, так и споры. Применяется в виде 40% р-ра (формалина) для дезинфицирующих целей.

Соли тяжелых металлов — ртути, серебра, меди, свинца, цинка, олова) вызывают коагуляцию белков клетки. Механизм бактерицидного действия заключается в том, что положительно заряженные ионы металлов адсорбирубтся отрицательно заряженной поверхностью бактерий и изменяют проницаемость их ЦПМ, что приводит к гибели бактерий. В качестве антисептиков широко используют нитрат серебра (ляпис), сульфат меди (медный купорос), дихлорид ртути (сулема), колларгол, протаргол и др.

Фенол и его производные (фенол, лизол, гексахлорофен, и др.) применяют как дезинфектанты, в меньших концентрациях — как антисептики. Препараты денатурируют белки и нарушают структуру клеточной стенки.

В качестве антисептиков давно и эффективно применяют различные красители (например, метиленовый синий, бриллиантовый зеленый, риванол или основной фуксин) которые обладают свойством задерживать рост бактерий.

По механизму действия на белок микробной клетки и вирусной частицы химические вещества делятся на 4 группы: окислители, коогулянты, гидролизанты, денатуранты.

• — окислители галогены и галогеносодержащие (препараты хлора, йода, брома), перекись водорода, перманганат калия, кислоты.
• — коогулянты — фенол и его производные, кислоты, соли тяжелых металлов, спирты,
• — гидролизанты — щелочи, мыла,
• — денатуранты — альдегиды, кислоты, красители

Понятие о стерилизации, дезинфекции.

Физические, химические, биологические факторы внешней среды обладают широким спектром действия на микроорганизмы. Использование этих факторов в лечебной и профилактической практике строго регламентируется государственным стандартом (ГОСТ), фармакопеей России, отраслевыми стандартами, государственным реестром лекарственных средств Росси, а также санитарными правилами и нормами Сан Пин). В лечебно-профилактических учреждениях использование этих 3-х факторов определяется системой мер, объединенных в понятие асептика.

Дезинфекция. Буквальный перевод — обеззараживание. Термин был введен Пастером. Дезинфекция — это комплекс мероприятий направленных на уничтожение или резкое подавление патогенных и условно-патогенных микроорганизмов во внешней среде. Внешняя среда — помещение, предметы обихода и быта, выделения больных, инструменты, лекарственные вещества и т. д. Целью дезинфекции является предупреждение передачи возбудителя от инфицированного организма неинфицированному через объекты окружающей среды. В зависимости от цели различают профилактическую, текущую, заключительную дезинфекцию.

Стерилизацияэто полное уничтожение всех микроорганизмов и их спор на обеззараживаемом объекте.

Микрофлора воздуха. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха Воздух не является благоприятной средой для жизнедеятельности микроорганизмов. Однако, попадая в воздух, многие микроорганизмы способны какое-то время находиться в жизнеспособном состоянии. Среди них большая группа патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Отбор проб, как и при исследовании любого объекта, является наиболее ответственным. Правильное взятие проб гарантирует точность исследования. В закрытых помещениях точки отбора проб устанавливаются из расчета на каждые 20 м² площади — одна проба воздуха, по типу конверта: 4 точки по углам комнаты (на расстоянии 0,5 м от стен) и 5-я точка — в центре.

Все методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментационные и аспирационные.

Седиментационный — наиболее старый метод, широко распространен благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей микробной обсемененности чашки с мясопептонным агаром оставляют открытыми на 5—10 мин или дольше в зависимости от степени предполагаемого бактериального загрязнения. При определении санитарнопоказательных микроорганизмов чашки оставляют открытыми в течение 40—60 мин.

По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в термостат на сутки для культивирования при температуре, оптимальной для развития выделяемого микроорганизма, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.

Более совершенными методами являются аспирационные, основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.). В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1), бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др.

Прибор Кротова. Принцип работы аппарата Кротова основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб проводят со скоростью 20−25 л/мин в течение 5 мин.

Таким образом, определяется флора в 100−125 л воздуха. При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 л.

Микрофлора воды. Методы санитарно-бактериологического исследования воды, показатели ее качества Вода является естественной средой обитания микробов, основная масса которых поступает из почвы, воздуха, с отбросами, стоками, выделениями человека и животных (мочой, калом) и т. д. Особенно много микроорганизмов в открытых водоемах и реках. К постоянно живущим в воде микроорганизмам относятся: азотбактер, нитробактер, псевдомонады, протеи, спириллы и др. Кроме сапрофитов в воде может быть возбудители инфекционных заболеваний животных и человека: возбудители дизентерии, сальмонеллезов, лептоспироза, и др.

Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивают по ОМЧ, коли-титру и коли-индексу.

Общее микробное число (ОМЧ) в воде определяют путем посева воды в стерильные чашки Петри, в которые затем добавляют расплавленный и остуженный до 42—45°С агар. При исследовании чистой воды засевают 1 мл, а при исследовании загрязненных вод делают посевы по 1 мл определенных разведений воды (1: 10— 1: 100 и более). Чашки помещают в термостат при 37 °C на 24 ч (или при 20—22°С на 48 ч) и по истечении срока инкубации подсчитывают все колонии, выросшие как на поверхности агара, так и в глубине его, выбирая чашки, в которых наиболее удобно произвести подсчет колоний.

Общее количество бактерий определяют в пересчете на число колоний, выросших при посеве 1 мл воды. Считают, что в чистой воде общее количество бактерий должно быть не более 100 в 1 мл воды, в воде сомнительной чистоты— от 100 до 1000, в загрязненной — свыше 1000. Общее количество бактерий в 1 мл водопроводной воды не должно превышать 100; для колодцев и открытых водоемов допускают до 1000.

Определение санитарно-показательных микроорганизмов.

Интенсивность фекального загрязнения воды характеризуют два показателя:

• 1) коли-индекс—количество кишечной палочки, обнаруженное в 1 л воды;
• 2) коли-титр — наименьшее количество миллилитров воды, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения количества БГКП используют метод мембранных фильтров, который основан на концентрировании определенных объемов воды на мембранных фильтрах с последующим посевом их на среду Эндо. Бродильные (титрационные) методы, предусматривают посев определенного количества воды на среды обогащения, а метод прямого посева — определенных разведений воды на среду Эндо. Бродильный метод удлиняет срок анализа на сутки.

Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрации БГКП из определенного объема воды на мембранном фильтре, выращивании их при 37 °C на среде Эндо, дифференциации выросших колоний и определении коли-индекса. Перед употреблением фильтры стерилизуют 10 мин кипячением в дистиллированной воде, меняя ее 3—5 раз. Мембранные фильтры помещают в фильтровальный аппарат Зейтца. После фильтрации пробы воды мембранный фильтр переносят на среду Эндо, разлитую в чашки Петри. Поверхность фильтра с осевшими на нее микробами должна быть обращена вверх. Посевы выдерживают в термостате при 37 °C в течение 18—24 ч. Если на фильтрах вырастают колонии, характерные для БГКП: красные, темно-красные с металлическим блеском или без него (лактозоположительные), из них готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют.

Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах Для оценки санитарно-гигиенического состояния объектов окружающей среды проводят санитарно-микробиологические исследования, которые позволят оценить опасность воды, воздуха, почвы и других объектов. Показателем неблагополучия является выявление патогенных микроорганизмов.

Санитарно-микробиологическое состояние объектов окружающей среды оценивают по ОМЧ (общему микробному числу микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы — 1мл воды, 1 г почвы, 1 м³ воздуха) объекта и обнаружение в нем санитарно-показательных микроорганизмов.

Содержание санитарно-показательных бактерий определяют по двум показателям: титру и индексу. Титр — это минимальный объем или масса, в котором выявляют бактерии. Индекс — это количество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в соответствующем количестве среды.

К санитарно-показательным микроорганизмам относятся представители облигатной микрофлоры организма человека и животных, для которых средой обитания является кишечник или дыхательные пути. Они характеризуются следующими свойствами:

• — постоянно выделяются с фекалиями или капельками слизи из дыхательных путей;
• — не имеют других мест обитания;
• — способны сохраняться в окружающей среде то же время, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или воздушно-дыхательных путях;
• — не способны размножаться вне организма хозяина и изменять свои свойства.

Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней Микробиологические (бактериологические, микологические, вирусологические) методы основаны на выделении чистой культуры возбудителя и ее последующей идентификации на основании морфологических, культуральных, биохимических, антигенных (серологических) и других признаков. Располагая чистой культурой бактерий, можно определить их родовую и видовую принадлежность, факторы патогенности, а также чувствительность к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам. Микологические исследования осуществляются реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика микозов достаточно надежна. Микологические исследования проводят при диагностике кандидозов путем определения нарастания количества клеток дрожжеподобных грибов рода Candida, а также глубоких микозов.

Вирусологический метод является наиболее достоверным в диагностике вирусных инфекций. Однако его трудоемкость, связанная с приготовлением культуры клеток, обработкой исследуемого материала, а также со сравнительно частым получением отрицательных результатов, ограничивают применение данного метода. Кроме того, он требует затраты сравнительно большого времени, особенно при проведении «слепых» пассажей. Во многих случаях вирусологический метод используют для ретроспективной диагностики вирусных инфекций.

Все микробиологические методы имеют определяющее значение в лабораторной диагностике, являются наиболее информативными и достоверными, особенно если они подтверждены дополнительными серологическими данными.