Фактор некроза опухоли-альфа в сыворотке крови

Доказано, что в формировании ишемического инсульта большое значение принадлежит локальному воспалению в мозговой ткани и повреждению эндотелия сосудов головного мозга. В связи с этим представлялось важным изучить содержание ФНО-а (Tumor necrosis factor — TNF, ФНО-а) в сыворотке крови у больных АГ с ишемическим инсультом. Ранее установлено, что ФНО-а является провоспалительным цитокином и продуцируется макрофагами и лимфоцитами. В связи с этим ФНО-а были изучены в сыворотке крови у 37 больных ишемическим инсультом при АГ.

Содержание ФНО-а определяли с помощью набора реагентов, предназначенного для количественного анализа в исследуемых образцах методом ИФА (фирма «Цитокин» г. С.-Петербург). В состав набора входил комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой, имеющей на внутренней поверхности лунок иммобилизированные моноклональные антитела к ФНО-а, 7 калибровочных проб аналитического буферного раствора, концентрированного раствора конъюгата стрептавин-пероксидазы, концентрированного буферного раствора для промывания лунок, субстратного буфера, 10% раствора кислоты («стоп-реагент») и гидроперита. Использовали два моноклональных антитела с различной эпитомной специфичностью к ФНО-а. Одно из них было иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе коньюгировано с биотином. На первой стадии анализа ФНО-а, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывался с антителами иммобилизированными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизированный ФНО-а взаимодействовал со вторыми антителами, меченными биотином. Количество связывающегося коньюгата было прямо пропорционально количеству ФНО-а в исследуемом образце. На последней стадии в лунки вносился коньюгат стрептавидин-пероксидазы. Во время инкубации в субстратной смеси происходило окрашивание раствора в лунках. Степень окраски была прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывали концентрацию ФНО-а в определенных образцах.

Для анализа брали 0,1 мл сыворотки крови, вносили ее в соответствующие лунки, после инкубации и декантировании во все лунки вводили 0,1 мл раствора антител, затем вносили 0,1 мл раствора коньюгата также во все лунки, тщательно перемешивали и хранили в темном месте. Добавляли 0,1 мл раствора гидроперита, вводили 0,1 мл субстрата смеси и инкубировали в темном месте в течение 15−20 мин в зависимости от степени развития окраски. Измеряли оптическую плотность в лунках при длине волны 492 нм с использованием планшетного фотометра.