Влияние механохимического препарата пихты на морфогенез картофеля (Solаnum Tuberosum L.) при микроразмножении in vitro

Микроклональное размножение растений in vitro используется для достижения различных задач, требующих получения большого количества «новых» растений идентичных материнскому. Преимуществом данного метода в отличие от классических приемов является высокий коэффициент размножения, возможность проводить размножение вне зависимости от времени года [1]. В современных условиях метод микроклонального размножения также является одним из основных, входящих в комплекс подходов и методов осуществляемых с целью оздоровления растительного материала. Широкое использование он получил в картофелеводстве, где его применение, играет определяющую роль, в оздоровлении различных сортов картофеля (Solanum tuberosum L.) имеющих ухудшенные семенные качества клубней в силу зараженности вирусной инфекцией, в том числе в латентной форме, а также в сохранении и размножении посадочного материала [2, 3]. Успех культивирования in virto различных сортов и видов растений во многом обусловлен оптимальным подбором среды (микро-, макроэлементы, витамины, органические соединения, гормоны) и условиями культивирования. Известно, что для стимуляции роста культуры ткани на питательной среде, в качестве дополнительных, к основному источнику органических веществ (сахароза), применялись кокосовое молоко, экстракт незрелых семян различных растений (кукуруза, сосна и др.), экстракт дрожжей [4]. Использование порошкового механохимического препарата пихты, содержащего водорастворимые соли тритерпеновых кислот, также показало высокую эффективность его регуляторной активности в отношении морфогенеза in vivo и in vitro пшеницы, эспарцета, люцерны, рапса [5, 6].

Целью данного исследования являлось изучение влияния механохимического порошка пихты на морфогенез картофеля при микроклональном размножении in virto на различных питательных средах.

Материалы и методы

древесный пихта морфогенез картофель В качестве объекта исследования были использованы клубни, предоставленные частным фермерским хозяйством, которое использует для выращивания и реализации, популярный среди населения Якутии, картофель «Синский». Клубни имели овально-округлую форму, с глазками средней глубины, гладкой красной кожурой и белой мякотью.

Методы, применяемые в исследовании, основывались на общепринятых приемах работы с культурами клеток и тканей согласно рекомендациям [3, 7]. Перед проращиванием клубни тщательно промывались с применением моющего средства. Побеги длиной не менее 2 см отделяли от клубней и в асептических условиях последовательно стерилизовали 3, 0% перекисью водорода в течение 1 мин, 5, 0% перманганатом калия 10 мин, 1, 0% хлорамином 5 мин, 70% этиловый спиртом 1 мин. Затем трижды отмывали автоклавированной дистиллированной водой.

В качестве исходных эксплантов для введения в культуру in vitro использовали апикальные меристемы побегов, которые помещали на агаризованную безгормональную питательную среду с минеральной основой Мурасиге-Скуга (МС). Пробирки с изолированными апикальными меристемами на питательных средах инкубировали при температуре 24−25⁰С, освещенности 3000 люкс, 16-ти часовом фотопериоде и 70% относительной влажности воздуха. Полученные асептические растения — регенеранты черенковали и высаживали на безгормональные питательные среды МС, Гамборга (Ѕ В5), Линсмайера-Скуга (Ѕ ЛС), а также на среды МС, Ѕ В5 дополненные нанокомпозитом на основе механоактивированной хвои пихты (МПН) из расчета 100 мг/л среды. МПН был получен в Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН.

Наблюдение за морфогенезом растений проводили на 15 и 30-ый дни, оценивали частоту развития побегов, высоту растений, число листьев, частоту ризогенеза, число корней и их длину.

Полученные результаты представлены в виде средней арифметической величины и ее стандартной ошибки (M ± SEM). Сравнение средних значений выборок проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), значимость отличий определяли с помощью критерия Даннета для множественных сравнений, при уровне p? 0.05. Расчет проводили с помощью пакета AnalystSoft, StatPlus — программа статистического анализа, v.2007.

Результаты и их обсуждение

В исследовании использовались безгормональные питательные среды (МС, Ѕ В5, Ѕ ЛС) на которые помещали микрочеренки, предварительно полученных in vitro растений из апикальных меристем побегов клубней картофеля. Показано, что на 15-е сутки культивирования во всех вариантах частота развития побегов составляла 100% (табл. 1). Наибольшая высота сформированных побегов была отмечена у растений культивируемых на агаризованной среде с минеральной основой МС. Высота растений культивируемых на этой среде превышала в 1, 1 и 1, 7 раза растения развивающихся на средах Ѕ ЛС и Ѕ В5 соответственно. Анализ данных по количеству листьев на эксплант выявил, что среда Ѕ В5 способствует увеличению их числа в 1, 2 и 1, 3 раза относительно вариантов со средами МС и Ѕ ЛС. Все исследуемые варианты характеризовались 100% частотой ризогенеза. Вместе с тем, отмечено увеличение на 24 и 30% числа корней в варианте с питательной средой МС по сравнению с Ѕ В5 и Ѕ ЛС соответственно. Длина корней статистически достоверно не отличалась в вариантах МС и Ѕ ЛС, за исключением снижения в 1, 2 — 1, 3 раза этого показателя у растений культивируемых на среде Ѕ В5.

Таблица 1. Морфогенез микрочеренков побегов картофеля на безгормональных агаризованных средах с различным минеральным составом

^* — различия статистически значимы по сравнению с другими вариантами (p < 0.05, ANOVA, критерий Даннета).

На 30-е сутки культивирования наблюдался значительный рост растений формировавшихся на среде Ѕ В5 и Ѕ ЛС, высота растений увеличилась в среднем на 4, 0 см., тогда как в варианте со средой МС, прирост побегов растений составил около 2, 0 см., относительно 15-го дня культивирования. Тем не менее, растения, культивируемые на среде Ѕ В5, были самыми низкорослыми по сравнению с другими вариантами. Количество листьев и корней на эксплантах статистически достоверно не отличалось во всех исследуемых вариантах. Прирост числа листьев к 30-му дню составил в среднем 4−5 листьев, а число корней не изменялось по отношению к 15-му дню наблюдения. Наиболее интенсивный рост корней был отмечен в варианте Ѕ В5, их длина увеличилась на 3, 0 см. относительно 15-го дня культивирования. Прирост корней в варианте МС и Ѕ ЛС составлял 2, 0 и 1, 0 см., соответственно. В целом, длина корней растений сформированных в условиях питательных сред МС и Ѕ В5 к 30-му дню статистически достоверно не отличалась.

Таким образом, использование трех агаризованных питательных сред с различным микрои макроэлементным составом показало наиболее интенсивный морфогенез микрочеренков картофеля на среде МС, что согласуется с литературными данными [3]. Вместе с тем, несмотря на более низкую начальную регенерацию клеточной ткани и интенсивность морфогенеза микрочеренков, которые были отмечены в первые две недели культивации на среде Ѕ В5, следует отметить, что дальнейшая культивация на этой среде способствовала активному росту и развитию побегов картофеля.

Известно, что регуляторы роста способствуют поступлению элементов минерального питания в корневую систему. Технологический цикл получения таких веществ сопровождается использованием дорогостоящих химических реагентов, многоступенчатыми этапами производства и т. д. В настоящее время, применение механохимических технологий позволяет получать не только высокоэффективные биологические активные препараты применяемые, в том числе в растениеводстве, а также перерабатывать разного рода отходы [8, 9]. Например, кору и зелень хвойных деревьев, шелуху риса, кору облепихи, что способствует получению сравнительно низкозатратных по себестоимости целевых биодоступных органических веществ [10, 11]. Ранее проведенные исследования по изучению влияния в качестве регулятора роста препарата МПН показали высокую эффективность в отношении морфогенеза пшеницы, стеблевых узлов эспарцета и люцерны. В концентрации 100 мг/л он стимулировал развитие каллусной ткани и вторичную регенерацию в базальной части эксплантов эспарцета, ускорял стеблевой морфогенез и укоренение побегов люцерны in vitro [5, 6].

Для изучения действия МПН на морфогенез микрочеренков побегов картофеля нами были выбраны среды МС и Ѕ В5, результаты исследования представлены в табл. 2.

Таблица 2. Морфогенез микрочеренков побегов картофеля на безгормональных агаризованных средах МС и Ѕ В5 дополненных МПН

^* — различия статистически значимы по сравнению с другим вариантом (p < 0.05, ANOVA, критерий Даннета).

Показано, что на 15-е сутки культивирования на питательных средах дополненных МПН частота развития побегов и ризогенеза составляли 100%. Наибольшие высота сформированных побегов и число корней на эксплант было отмечено у растений, культивируемых на агаризованной среде с минеральной основой МС дополненной МПН. Высота растений и число корней у побегов, культивируемых на этой среде, превышали в 1, 3 и 1, 4 раза, соответственно, растения, которые развивались на среде Ѕ В5 дополненной МПН. Анализ данных по количеству листьев на эксплант и длины корней не выявил статистически значимых отличий.

На 30-е сутки культивирования морфогенетические показатели побегов культивируемых на двух средах дополненных МПН отличались только по показателю длины корней. Так, среда Ѕ В5 дополненная МПН привела к активации роста корешков побегов картофеля в 1, 3 раза по сравнению с вариантами: МС, МС дополненный МПН и Ѕ В5. Также следует отметить, что добавка механохимического порошка древесной зелени пихты в агаризованную среду МС приводит к достоверному снижению роста (высоты) побега картофеля (табл. 1 и 2).

Заключение

Использование препарата МПН из хвои пихты выявило его регуляторную активность по отношению к морфогенезу микрочеренков картофеля in vitro. В зависимости от минерального состава безгормональной агаризованной среды, на которой культивировались микрочеренки картофеля, добавление препарата в концентрации 100 мг/л вызывало стимулирование роста корешков побегов (среда Ѕ В5), уменьшение высоты побега (среда МС), обусловленное снижением длины междоузлий и не оказывало влияние на число листовых пластинок.

• 1. Лутова Л. А. Биотехнология высших растений / Л. А. Лутова — Изд. 2-е. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2010. — 240 с.
• 2. Зыкин А. Г. Вирусные болезни картофеля / А. Г. Зыкин — Л.: Колос, 1976. — 152 с.
• 3. Трофимцом Л. Н. Оздоровление и ускоренное размножение семенного картофеля / Л. Н. Трофимцом, Д. П. Остапенко, В. В Бойко, и др. / Методические рекомендации; М., 1985. — 35 с.
• 4. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко — М: Наука, 1964. — 272 с.
• 5. Рожанская О. А. Особенности морфогенеза эсварцета и люцерны in vitro. / О. А. Рожанская, В. Г. Дарханова, Н. С. Строева, и др. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 2008. — № 5. — С. 58−65.
• 6. Рожанская О. А. Влияние регуляторов роста растительного происхождения на морфогенез рапса in vitro. / О. А. Рожанская, Н. В. Юдина, О. И. Ломовский, К. Г. Королев // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 2003. — № 2. — С. 108−112.
• 7. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф. Л. Калинин, В. В. Сарнацкая, В. Е. Полищук — Киев: Наукова думка. 1980. — 320 с.
• 8. Oleg Lomovsky, Kirill Korolyov, Young Soon Kwon // Proceedings of the 7-th Russian-Korean International Symposium on Science and Technology «KORUS-2003», Ulsan, Republic of Korea, 2003. Vol. 1.
• 9. Королев К. Г., Ломовский О. И., Рожанская О. А., Васильев В. Г. // Химия природных соединений [K.G. Korolev, O.I. Lomovskii, O.A. Rozhanskaya, V.G. Vasil’ev //Chem. Natural compounds], 2003. 39:4.
• 10. Шевцов С. А. Тритерпеноиды из видов Abies. V: Строение и спектральные свойства основных 9в-ланостановых кислот хвои пихты сибирской / С. А. Шевцов, В. А. Ралдугин // Химия природ. соед. 1988. № 3. С. 364−371.
• 11. Патент № 2 244 426. МПК A01N65/00, A61K35/78, C07C51/41. Препарат, содержащий водрастворимые соли тритерпеноых кислот и способ его получения. Ломовский О. И., Королев К. Г.; заявитель и патентообладатель Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН (ИХТТМ СО РАН) (RU). № 2 003 125 160/15. Заявлено 11.08.2003. Опубл.: 20.01.2005, БИ № 2.