В помощь антибиотикам

Важнейшей проблемой современности является быстрая эволюция бактерий в направлении приобретения устойчивости к антибиотикам, приводящая к возрождению многих заболеваний человека.

Профессор Йельского университета (США) Сидни Альтман, продолжая исследования в области каталитической способности РНК, стал разрабатывать способы борьбы с инфекционными заболеваниями (антибактериальная и антималярийная терапия), используя каталитические способности конкретного РНК-фермента — рибонуклеазы Р. Конечная цель — создать препарат, который мог бы быть альтернативой в случае устойчивости инфекции к антибиотикам. На конкретных объектах исследований разрабатываются фундаментальные основы подходов, которые могли бы быть общими для лечения многих инфекционных заболеваний. В перспективе синтезировать определённые соединения, которые могут быть легко модифицированы для борьбы, как с бактериями, так и с малярией. Это направление исследований представляет перспективную альтернативу применению в медицине антибиотиков, возможности которых стремительно тают. Сидни Альтман разрабатывает это важнейшее направление, в частности, совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) [6].

Как зарождались знания, составляющие основу практического применения теорий и методов молекулярной биологии РНК Лауреат Нобелевской премии за открытие рибозимных свойств РНК Сидни Альтман (Олтмен, 1939 г. р.) всегда был связан с Россией: его отец Виктор Альтман эмигрировал из СССР в 1934 году. Заняться молекулярной биологией начинающему учёному Альтману посоветовал русский физик Георгий Гамов.

В 1954 году, через год после открытия Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком двуспиральной структуры ДНК, в США Георгий Гамов (самый молодой член-корреспондент АН СССР, советский учёный-физик, покинувший СССР в 1933 году) неожиданно внёс существенный вклад в становление молекулярной биологии, впервые поставив задачу генетического кода. Он понял, что структуры белков, состоящих из 20 основных (природных) аминокислот — должна быть зашифрована в последовательности из четырёх возможных нуклеотидов, входящих в состав молекулы ДНК.

Исходя из простых арифметических соображений, Гамов показал, что при сочетании 4-ёх нуклеотидов тройками получается 64 различные комбинации, чего вполне достаточно для записи наследственной информации. Таким образом, он был первым, кто предложил кодирование аминокислотных остатков триплетами нуклеотидов [17].

Практически генетический код позволил расшифровать метод бесклеточной системы синтеза белка (in vitro). Первые результаты в этом направлении были получены в 1961 году, когда М. Ниренберг и Х. Матеи синтезировали упрощённую форму мРНК, состоящую из одинаковых нуклеотидов и обнаружили, что в её присутствии происходит образование длинной цепи белковоподобной молекулы, состоящей из аминокислот одного-единственного вида. Искусственная мРНК представляла собой полинуклеотид поли-У, в котором все нуклеотиды содержали только одно основание — урацил. Когда поли-У добавляли к экстракту из клеток бактерии E. coli (кишечная палочка) наряду с аминокислотами, а также соединения, способными служить источниками энергии, начинался синтез полипептидной цепи, построенной только из остатков аминокислоты фенилаланин. Так было обнаружено, что кодон УУУ соответствует фенилаланину.

Этот первый успех указал путь, следуя которому в скором времени удалось установить кодоны и для ряда других аминокислот; требовалось только перепробовать различные формы синтетических мРНК. В ближайшее время были открыты тРНК и установлено, что синтез белка в клетке начинается с формилметионина, открыты были инициирующие кодоны АУГ и ГУГ. Тогда возник вопрос, каким образом некоторые синтетические мРНК, например поли-У, которые, конечно, не содержат таких кодонов, ухитряются как-то заставлять рибосомы синтезировать полипептиды?

Вероятно, это происходит по ошибке — из-за того, что рибосомы ведут себя «не по инструкции». (Следовательно — ирония судьбы! — генетический код был расшифрован именно благодаря тому, что искусственные системы способны иногда так удачно ошибаться!). Каковы же те обстоятельства, которые приводят к тому, что эти системы совершают «нужные» ошибки?

Один из факторов был вскоре найден. Им оказалась высокая концентрация магния в бесклеточных системах. При высоком содержании магния способность строить полипептиды приобретают многие синтетические мРНК; при более низких концентрациях, синтез могут вести только те РНК, в которых присутствуют кодоны АУГ и ГУГ. Каким образом магний инициирует синтез? На этот вопрос нет однозначного ответа [25].

О различии молекулярных механизмов формирования морозоутойчивости озимой мягкой пшеницы и озимого ячменя Итак, концентрация магния. Установлено, чем больше содержится магния в рРНК, тем активнее синтезируют белок (полифенилаланин) рибосомы зародышей пшеницы в бесклеточной системе синтеза белка (in vitro) на искусственной матрице (поли-У) [42]. Вполне возможно, что концентрация катионов магния в клетке определяет интенсивность синтеза «ошибочных» полипептидов, предположительно расширяющих адаптационные свойства организмов [19, 20, 21, 25].

Морозоустойчивость озимой мягкой пшеницы прямо пропорциональна периоду полужизни мРНК, но обратно пропорциональна периоду полужизни рРНК и содержанию катионов Mg++ в РНК [16]. Вероятно, этим можно объяснить факт сортоспецифического усиления in vitro трансляционной активности полисом из проростков пшеницы и ячменя под влиянием закаливающей температуры [16, 25], тогда как в этих условиях длина поли-А-хвоста мРНК (энхансера трансляции) у пшеницы увеличивалась, а у ячменя сокращалась [2, 16]. Но ячмень содержит гораздо больше катионов магния по сравнению с пшеницей [12], что, возможно, и определяло увеличение трансляционной активности рибосом ячменя.

Следовательно, увеличение трансляционной активности полирибосом может происходить как за счёт увеличения длины поли-А-хвоста мРНК как энхансера трансляции (пшеница), так и за счёт увеличения содержания катионов магния в рРНК (ячмень). Можно полагать, что озимый ячмень формирует морозоустойчивость на основе более древнего молекулярного механизма — адаптационного усиление трансляционной активности за счет вариации в содержании магния в рРНК [11, 13, 22].

Но озимая мягкая пшеница реагирует на закаливающие температуры сортоспецифическим усилением полиаденилирования мРНК [2, 16, 23]. Этот молекулярный механизм, вероятно, более поздний и является более прогрессивным по сравнению с вариациями содержания магния в рРНК. Отсюда, возможно, и более высокая морозоустойчивость озимой мягкой пшеницы по сравнению с озимым ячменём.

Следовательно, изменение концентрации катионов магния в клетке противоположно действует на стабильность мРНК и рРНК. Увеличение концентрации магния приводит к стабилизации рРНК и дестабилизации мРНК.

Таким образом, есть основания полагать, что повышение морозостойкости сорта озимой мягкой пшеницы сопровождается стабилизацией мРНК и дестабилизацией рРНК. Предполагается, что стабилизация рРНК определяется укреплением молекулы за счёт катионов магния, в тоже время весьма вероятно, что катионы магния стимулируют укорочение терминальной поли-А-последовательности, определяющей стабильность и трансляционную активность мРНК, через усиление прочности определённых структур мРНК, определяющих скорость её деаденилирования. Такой структурой может быть шпилька в 3'-нетранслируемой области мРНК, с которой взаимодействуют белки, деаденилирующие мРНК [38].

Эта принципиально важная гипотеза требует детальной экспериментальной проверки.

Об особенностях молекулярной биологии озимой мягкой пшеницы сорта Безостая 1.

«Генотип должен превалировать над средой».

Н.И. Вавилов Одним из часто встречающихся, довольно досадным моментом при работе с РНК является их деградация в процессе хранения или манипулирования, даже в случае хорошо очищенных препаратов. Обычно это связывают с наличием РНКаз, занесенных с посудой и реактивами или попавших в препараты РНК в процессе выделения. Однако было показано, что применение мощного ингибитора РНКаз — диэтилпирокарбоната во время выделения РНК с последующей усиленной депротеинизацией полученных препаратов и использование растворов, реактивов и посуды, обработанной диэтилпирокарбонатом и протеиназой К, не приводит к полному предотвращению деградации РНК. Известно, что если все работы проводить с очищенным препаратом РНК при температуре 0−4оС, то указанной деградации не наблюдается. Следовательно, существует определенный оптимум условий для проявления данной РНКазной активности: РНК из животных клеток наибольшей деградации подвергаются при pH 8,5 в присутствии двухвалентных катионов: Ca++; Mg++ или Mn++. 15].

В 90-е годы ХХ века было показано тождество закономерностей Mg-зависимого распада мРНК в живой клетке (in vivo) и в водных растворах (in vitro) [15, 16, 41]. На протяжении последних сорока лет многие исследователи отмечали способность выделенной из клетки РНК разрушаться в присутствии катионов металлов [15]. Но от внимания исследователей ускользал тот факт, что разрушение происходит по тем же законам, что и в живой клетке, отражая генетические особенности и физиологическое состояние организма. В фундаментальных науках всегда имел значение объект исследования. Удачность выбора объекта (или случай) определяет скорость и эффективность исследований, обширность и глубину полученной информации. Закономерности Mg-зависимого распада мРНК стали очевидными, когда объектами исследований оказались проростки двух сортов озимой мягкой пшеницы, контрастных по морозостойкости (высокоморозостойкий сорт Краснодарская 39 и среднеморозостойкий — Безостая 1).

Как показали исследования, норма реакции на закаливающие температуры у сорта Безостая 1 на молекулярном уровне относительно узка по всем компонентам белоксинтезирующей системы — от амплитуды изменения трансляционной активности полирибосом, длины поли-(А)-хвоста мРНК, стабильности мРНК до амплитуды колебаний электрофоретического спектра рРНК [16, 23]. Это происходит на фоне относительно высокого содержания катионов магния в зерне Безостой 1 и соответствует реальному районированию сортов: высоко морозоустойчивый сорт Краснодарская 39 (относительно низкое содержание магния в зерне) способен давать урожай вплоть до Самарской области, в то время как средне морозоустойчивый сорт Безостая 1 давал и даёт великолепные урожаи, но в относительно узкой южной полосе.

Особенности сорта Безостая 1 образно можно представить как глухонемого человека в группе пахарей. Товарищи отвлекаются на различные развлекательные и опасные аспекты жизни, а глухонемой пашет и пашет. Поэтому в конечном итоге выясняется, что он вспахал больше всех. Но это только при условии относительно благоприятных обстоятельств.

Этот вывод позволяет объективно понять природу феномена сорта Безостая 1 и, отталкиваясь от этих знаний, заложить основу понимания сакральных молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе селекции и определяющих её будущие успехи. Таким образом, Безостая 1 фактом своего существования великолепно подтверждает вывод, сделанный Н. И. Вавиловым в 30-ых годах ХХ века: «Генотип должен превалировать над средой».

Фундаментальные исследования молекулярной биологии РНК сорта Безостая 1 привели к прикладным исследованиям, способствовали формированию элементов молекулярных основ теории морозоустойчивости и возможности разработки простых методов оценки морозоустойчивости сортов озимой мягкой пшеницы по содержанию нуклеиновых кислот и катионов магния в зрелом зерне [9, 10, 20, 21].

В фундаментальном плане, эти исследования привели к открытию закономерностей Mg+±зависимого распада мРНК и рРНК in vitro (система ommp) [15, 16, 23, 41]. Это событие в методологии способствовало созданию фундамента для развития новой главы в молекулярной физиологии сельскохозяйственных растений, так как новые шаги в методологии, как правило, ведут за собой длинную цепь новых фактов, которые дополняют и изменяют научное мировоззрение, предоставляют принципиально новые возможности для практики.

Молекулярные маркеры (ДНК-овые, белковые) являются чрезвычайно эффективным инструментом генетических исследований растений. Однако их статичность не позволяет количественно оценить важнейшие свойства культурных злаков (например, стрессоустойчивость и фотопериодизм). Как познание электричества и развитие электротехники стало возможным только с появлением электродинамики на основе электростатики, так и статичные молекулярные маркеры должны быть существенно дополнены молекулярно-кинетическими маркерами, способными количественно оценить экспрессию основных регуляторных генов или дать интегральную характеристику всех экспрессирующихся генов определенного генотипа в конкретных условиях роста.

Весьма существенным шагом в познании природы самораспада мРНК стало установление факта вариабельности содержания катионов магния (Mg++) в РНК (рибосомной и матричной) в зависимости от генотипа (сорта) и условий окружающей среды. С практической точки зрения очень важным представляется использование этого показателя (количество катионов магния) для долгоживущей высокополимерной РНК зрелого зерна пшеницы в целях оценки степени морозостойкости сорта: чем выше содержание катионов магния, тем ниже морозостойкость сорта [11, 12, 21].