Определение величин IC50 для ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми соединениями в препаратах мозга и крови

Величинны IC50 (М) (концентрация соединения, необходимая для снижения активности фермента на 50%) для ингибирования АХЭ, БХЭ, НТЭ и КЭ исследуемыми соединениями в крови и мозге мышей определяли при 20 минутах инкубации препарата ткани в соответствующем буфере с исследуемыми соединениями в диапазоне концентраций от 10−11 до 10−3 М. Использовали пулированные образцы крови и препаратов 9S фракции гомогената мозга. Соединения растворяли в ацетоне, конечная концентрация которого в реакционной смеси составляла не более 1% об/об. Объем реакционной смеси составлял 3 мл, контрольные пробы содержали соответствующий объем растворителя без ингибитора. Определение IC50 проводили в условиях, аналогичных для определения активности ферментов в крови и в 9S препаратах гомогената мозга (Глава 2.5).

Реакции ингибирования АХЭ, БХЭ и КЭ начинали внесением 0.03 мл раствора исследуемого ингибитора в ацетоне, инкубировали 20 мин. и останавливали реакцию внесением раствора соответствующего субстрата. Затем определяли остаточную активность ферментов в препаратах крови и мозга в соответствии с методами, описанными выше. Измерения проводили на на спектрофотометре Gilford-250 (England). Каждое измерение проводили в трипликате.

Для исследования ингибирования НТЭ в препаратах мозга использовали 50 мкл 9S фракции гомогената мозга, после первой 20-и минутной преинкубации с PO вносили исследуемые ингибиторы в объеме 20 мкл. Через 20 минут реакцию ингибирования останавливали внесением избытка субстрата. Контрольные пробы содержали 20 мкл ацетона без ингибитора. Объемеакционной смеси составлял 1 мл. Измерение остаточной активности НТЭ в препаратах мозга проводили спектрофотометрически в условиях аналогичных для определения активности НТЭ в 9S фракции гомогената мозга (Глав 2.5).

Для ингибирования НТЭ в крови исследуемые ФОС (в диапазоне концентраций 10−11 до 10−3 М) вносили в реакционную смесь после первой 20-и минутной преинкубации с PO в объеме 5 мкл, через 20 минут реакцию ингибирования останавливали внесением субстрата. Контрольные пробы содержали 5 мкл ацетона без ингибитора. Остаточную активность НТЭ в крови определяли амперометрическим методом при 37oC, как описано выше.

Величины IC50 определяли из анализа зависимости остаточной активности фермента (Vi/V0Ч100%, где V0 — активность фермента в отсутствие ингибитора, Vi — остаточная активность фермента при данной концентрации ингибитора) от концентрации ингибитора. Вычисление величин IC50 проводили использованием программы Origin 6.1 (OriginLab Corp., Northampton, MA).