Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных ингибиторов сериновых эстераз

Целью данного эксперимента являлось получение и анализ эстеразного профиля серии O,O-диалкил-O-(1-этоксикарбонил-2,2,2-трифторэтил) фосфатов (О-фосфорилированных этилтрифторлактатов, TFL) общей формулы где R= CH3, C2H5, i-C3H7, n-C3H7, i-C4H9, n-C4H9, n-C5H11.

Предполагалось, что по аналогии с ранее изученными O, O-диалкил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил) фосфатами (О-фосфорилированными гексафторизопропанолами, PFP) [64, 455], трифторлактатный фрагмент в данных соединениях будет выполнять роль уходящей группы, и TFL, как ингибиторы АХЭ и БХЭ, могут представлять интерес в качестве потенциальных терапевтических средств для улучшения когнитивных функций при ряде нейродегенеративных расстройств.

Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ О-фосфорилированными этилтрифторлактатами

Для получения эстеразного профиля TFL была исследована кинетика ингибирования данными соединениями четырех сериновых эстераз — АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ. Кинетические исследования проводились с использованием коммерческих препаратов ферментов: АХЭ эритроцитов человека, БХЭ сыворотки крови лошади, КЭ печени свиньи (Sigma-Aldrich, США), и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛиоНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории [458] (далее ферментные препараты).

Проведенные исследования показали, что TFL необратимо ингибируют АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ с типичной для ФОС кинетикой ингибирования: зависимость степени ингибирования эстеразной активности от времени имеет псевдо-первый порядок, а наклоны прямых в полулогарифмических координатах lg (V0/Vt) = f (t) в случае АХЭ, БХЭ, КЭ пропорциональны кон-центрации ингибитора. При ингибировании НТЭ наблюдалось кинетическое проявление образования комплекса Михаэлиса, что позволило определить индивидуальные кинетические константы процесса ингибирования фермента — константы Михаэлиса (Ka, M) и константы фосфорилирования (k+2, мин-1).

E — фермент, I — ингибитор, ki — бимолекулярная константа ингибирования (М-1мин-1). Типичные графики зависимости степени ингибирования активности АХЭ, БХЭ и КЭ от времени на примере diPr-TFL представлены.

Данные зависимости позволяют оценить константу скорости псевдопервого порядка при данной концентрации ингибитора: k? = 2.303 Ч tgб, а затем бимолекулярную константу ингибирования: ki = 2.303 Ч tgв (М-1мин-1).

Типичные графики зависимости lg (V0 /Vt) от времени инкубации для трех возрастающих концентраций ингибитора на примере diPr-TFL представлены на Рисунке 3.1.-2А. При ингибировании НТЭ не наблюдается пропорциональности в зависимости константы скорости псевдопервого порядка (k? = 2.303 Ч tgб) от концентрации ингибитора (Рис. 3.1.-2Б). Построение зависимостей в координатах [I]/2.3 tgб от [I] дает возможность получить линейную зависимость (Рис. 3.1.-2В) в соответствии с уравнением.

[I] / k? = Ka / k+2 + [I] / k+2 ,.

из которого определяются индивидуальные кинетические параметры процесса.

— константа Михаэлиса (Ka, M) и константа фосфорилирования (k+2, мин-1). Таким образом данные параметры были определены для ингибирования НТЭ O-фосфорилированными этилтрифторлактатами. Полученные результаты приведены.

Таблица 3.1. — 1. Кинетические параметры ингибирования НТЭ O-фосфорилированными этилтрифторлактатами.

Как видно из Таблицы 3.1. 1, константа фосфорилирования НТЭ k+2 (мин-1) практически не зависит от структуры алкильных радикалов, тогда как связывание TFL в активном центре НТЭ, которое характеризуется константой Михаэлиса (Ka), улучшается с увеличением гидрофобности соединений. Рисунок 3.1.-3А демонстрирует зависимость константы Михаэлиса от гидрофобности алкильных радикалов (рCH2=0.5 по Хэнчу [460]). Эта зависимость описывается линейным уравнением:

• -lg Ka (НТЭ) = (1.70 ± 0.49) + (0.97 ± 0.15)?р
• (n = 7, r = 0.944, s = 0.490, F = 41.15, P = 0.137)

Тангенс угла наклона близкий к 1 в зависимости lgKa (НТЭ) от гидрофобности алкильных радикалов (ур-е 1, Рис. 3.1. 3А) подтверждает экстракционный механизм взаимодействия НТЭ с фосфорорганическими ингибиторами, предложенный ранее [457]. Показано наличие строгой корреляция между ингибиторной активностью TFL в отношении НТЭ.

(ki, М-1мин-1) и связыванием соединений в активном центре фермента, (Ka, М): r = 0.998, n = 7, р < 0.0001.

В результате проведенных кинетических исследований определены величины бимолекулярных констант ингибирования АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ производными TFL, т. е. получен эстеразный профиль каждого соединения Таблица 3.1. — 2. Ингибиторная активность TFL (ki, М-1мин-1) в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ и аддитивная гидрофобность алкильных радикалов по Хэнчу (Ур CH2=0.5).

Как следует из Таблицы 3.1.-2 и Рисунка 3.1.-4, ингибиторная активность TFL в отношении всех четырех сериновых гидролаз возрастает с увеличением гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы, при этом БХЭ и КЭ в большинстве случаев ингибируются более эффективно по сравнению с первичными мишенями АХЭ и НТЭ. Стерические препятствия — наличие заместителя в б-положении алкоксильного радикала — cнижают ингибиторную способность соединений.

Анализ эстеразного профиля О-фосфорилированных этилтрифторлактатов

Для анализа эстеразного профиля TFL использованы величины их ингибиторной активности в отношении 4-х эстераз (Табл. 3.1.-2) и величины ингибиторных селективностей (S), рассчитанные как отношения соответствующих ki (М-1мин-1): селективность соединения в отношении эстеразы X в сравнении с эстеразой Y определяли как SX/Y = ki (EX)/ki (EY) (Табл. 3.1.-3), где Х, Y = АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ. В сумме это дает для моделирования 9 параметров, каждый из которых важен для определенных аспектов результирующего фармакологического профиля соединений.

Таблица 3.1. — 3. Ингибиторная селективность TFL в отношении четырех сериновых эстераз.

Так, отношения ki(БХЭ)/ki(АХЭ) и ki(КЭ)/ki(АХЭ) характеризуют селективность соединений в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, и, как мы полагаем, могут рассматриваться в качестве характеристики вкладов БХЭ и КЭ как вторичных мишеней-скэвенджеров в формирование острой холинергической токсичности соединения [455, 473−475]. Аналогично отношения ki(БХЭ)/ki(НТЭ) и ki(КЭ)/ki(НТЭ) характеризуют вклад БХЭ и КЭ в формирование отставленной нейротоксичности соединения.

Отношениеki(НТЭ)/ki(АХЭ)=RIP (RelativeInhibitorPotency) — относительная ингибиторная активность соединений в отношении ферментов-мишеней отставленной (НТЭ) и острой (АХЭ) нейротоксичности. Это отношение коррелирует с отношением между LD50 и минимальной нейропатичной дозой, и для соединений, которые в соответствии со своей структурой способных стареть, используется в качестве индекса, характеризующего нейропатичный потенциал соединения [223, 224, 226]. Величина RIP > 1 указывают на то, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС данным соединением, будет меньше LD50, тогда как при RIP < 1 ОНТФОС может инициироваться при дозах, больших LD50 [79, 262, 296, 299, 309, 476, 477].

Как следует из Таблиц 3.1.-2 и 3.1.-3, исследуемые соединения являются слабыми или средней силы ингибиторами АХЭ и более эффективно ингибируют БХЭ в сравнении с АХЭ, особенно при увеличении гидрофобности алкильных радикалов. Для соединений с R? Pr характерна также повышенная селективность в отношении КЭ в сравнении с АХЭ.

Довольно низкая анти-АХЭ активность TFL наряду с более эффективным связыванием соединений с БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, особенно при увеличении гидрофобности алкильных радикалов, позволили предположить невысокую острую токсичность соединений. Действительно, при определении острой токсичности на мышах (в/бр, 24 часа) были получены низкие величины.

LD50: для diEt-TFL — 720 (623 ч 817) мг/кг и для diBu-TFL — 1560 (1350 ч 1780) мг/кг.

Анализ величин RIP = ki(НТЭ)/ki(АХЭ), характеризующих нейро-патичный потенциал соединений [223, 226], показывает, что TFL с короткими R (Me, Et) значительно сильнее ингибируют АХЭ, чем НТЭ (RIP = 0.038 и 0.046, соответственно), в то время как соединения с длинными радикалами (Bu и Pent) в большей степени подавляют НТЭ (RIP = 2.15 и 4.04; Табл. 3.1.-3). Т. е. избирательность действия TFL в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ, возрастает с увеличением длины и, соответственно, гидрофобности алкильных радикалов.

Как подробно обсуждалось в Литературном обзоре диссертации, необходимым условием инициирования ОНТФОС является старение фосфорилированной НТЭ — деалкилирование алкоксигруппы, связанной с атомом фосфора в фосфорилированном по остатку серина ферменте [223, 226]. В структуре TFL присутствуют алкоксильные группы, т. е. фосфорилированный этими соединениями фермент способен «стареть». В связи с этим, высокие величины RIP для TFL с R = Bu и Pent (2.15 и 4.04, соответственно) позволяют предположить [223, 262], что эти соединения могут вызывать ОНТФОС в дозах, меньших LD50. Полученные результаты согласуются с представленными в литературе данными о высокой нейропатичности фосфорорганических соединений с длинными алкоксильными радикалами [79, 190, 249, 282].

Анализ эстеразного профиля исследуемых соединений проводили с помощью количественного анализа связи структура — ингибиторная активность и структура — ингибиторная селективность (QSAR) с построением моделей Хэнча [460]. Cвязь между структурой и антиферментативной активностью/селективностью соединений анализировали с использованием множественной линейной регрессии. При этом, учитывая характер зависимостей lgki от гидрофобности (Рис. 3.1.-4), мы использовали модели «гидрофобность — ингибиторная активность» с включением в них стерических факторов. Ранее было показано, что при анализе структура — активность в гомологичных рядах фосфатов и фосфонатов не удается выявить влияния электронных свойств заместителей на ингибиторную способность соединений [455, 478−480]. В качестве физико-химических дескрипторов мы использовали константы гидрофобности Хэнча (рCH2 = 0.5) и стерические константы Чартона (Evs) для алкильных и алкоксильных заместителей [460]. Значимость полученных корреляционных уравнений оценивали по величине r — коэффициента множественной корреляции, s — стандартного отклонения, F — секвенциального критерия Фишера и Р — уровня значимости критерия Фишера. Зависимость анти-АХЭ активности TFL от гидрофобности алкильных Модель существенно улучшается при исключении из анализа соединения с б-р азветвленным i-Pr радикалом (3):

Использование стерических характеристик алкильных заместителей У Evs ® серьезно ухудшает статистические параметры модели:

n = 7, r = 0.880, s = 0.408, F = 6.84, P = 0.051.

Зависимость анти-НТЭ активности TFL от гидрофобности алкильных

Как и в случае АХЭ, наилучшее уравнение, описывающее зависимость ki (НТЭ) от структуры молекулы, получается при включении в анализ стерических характеристик алкоксильных заместителей Evs (RO) (6):

lg ki (НТЭ) = (1.05 ± 0.66) + (1.19 ± 0.12)Ур — (1.56 ± 0.68)УEvs (RO).

(n = 7, r = 0.981, s = 0.341, F = 52.13, P = 0.136).

При использовании стерических характеристик алкильных заместителей Evs ® статистические характеристики модели ухудшаются, хотя и в меньшей степени по сравнению с АХЭ: n = 7, r = 0.956, s = 0.519, F = 21.302, P = 0.0074.

Как видно из приведенных уравнений, гидрофобные взаимодействия являются более значимыми для ингибирования НТЭ, чем для АХЭ (сравнение кэффициентов в ур-ниях 5 и 3, 6 и 4). В случае б-р азветвленных заместителей стерические взаимодействия снижают ингибиторную активность соединений в.

При включении в анализ стерических характеристик алкоксильных заместителей Evs (RO) получается наилучшее уравнение, описывающее зависимость ki (БХЭ) от структуры молекулы, (8):

(n = 7, r = 0.962, s = 0.298, F = 12.58, P = 0.033).

При использовании стерических характеристик алкильных заместителей У Evs ® статистические характеристики ухудшаются:

n = 7, r = 0.921, s= 0.427, F = 5.62, P = 0.095.

Зависимость анти-КЭ активности TFL от гидрофобности алкильных радикалов описывается уравнением (9):

Наилучшее уравнение, описывающее зависимость анти-КЭ активности TFL от структуры молекулы получается при включении в анализ стерических характеристик алкоксильных заместителей Evs (RO) (10):

lg ki(КЭ) = (1.44 ± 0.92) + (2.26 ± 0.93)Ур — (0.18 ± 0.14)(Ур)2 — (1.81 ± 1.19)У Evs.

При использовании стерических характеристик алкильных заместителей У Evs.

® модель ухудшается: n = 7, r = 0.963, s = 0.528, F = 13.00, P = 0.0316.

Как видно из проведенного анализа, наилучшие уравнения, описывающие зависимость между структурой TFL и их антиэстеразной активностью, были получены при включении в модели стерических констант Чартона для алкоксильных У Evs (RO), но не алкильных У Evs ® заместителей. Это может свидетельствовать о существенном влиянии стерических свойств заместителей на стадии фосфорилирования ферментов [478].

Анализ ингибиторной способности TFL в отношении исследуемых сериновых эстераз показал, что гидрофобные взаимодействия играют важную роль при ингибировании всех эстераз, стерические препятствия снижают антиэстеразную активность.

Далее мы провели анализ связи структура — ингибиторная селективность с построением моделей Хэнча [460].

Зависимость ингибиторной селективности TFL в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ от гидрофобности алкильных радикалов описывается уравнением (11), которое демонстрирует линейное возрастание нейропатичного потенциала TFL (ki(НТЭ)/ki(АХЭ) = RIP) с увеличением гидрофобности Селективность TFL в отношении биомишеней-скэвенджеров (БХЭ и КЭ) по сравнению с мишенью острого токсического действия (АХЭ) описывается Эти уравнения описывают изменение потенциального вклада вторичных мишеней, БХЭ и КЭ, в формирование острой холинергической токсичности TFL с изменением гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы: с увеличением гидрофобности возрастает ингибиторная селективность соединений в отношении БХЭ и особенно КЭ в сравнении с ингибиторной активностью в отношении АХЭ. Т. е. с ростом гидрофобности соединений возрастает защитная роль БХЭ и КЭ при формировании острой холинергической токсичности TFL. Это иллюстрирует Рисунок 3.1. 6, где прерывистые линии для селективности S (БХЭ/АХЭ) и S (КЭ/АХЭ) получены по уравнениям (12) и (13) соответственно. Аналогичная закономерность была показана ранее для гомологичных рядов структурно близких О-фосфорилированных гексафторизопропанолов [455] и других гомологичных диалкилфосфатов [478, 481].

Возрастание степени связывания TFL на токсико-кинетической стадии c эстеразами-скэвенджерами при увеличении гидрофобности молекулы снижает количество соединения, достигающего мишени — АХЭ, что должно приводить к снижению острой холинергической токсичности для более гидрофобных соединений. Это полностью согласуется с результатами по определению острой токсичности диэтильного и дибутильного производных TFL для мышей (в/бр, 24 ч): острая токсичность более гидрофобного diBu-TFL (LD50 = 1560 мг/кг) вдвое ниже, чем у diEt-TFL (LD50 = 720 мг/кг).

lg [ki(БХЭ)/ki(НТЭ)] = (2.11 ± 0.22) + (0.47 ± 0.16) Ур — (0.17 ± 0.03)(Ур)2.

(n = 7, r = 0.993, s = 0.109, F = 140.423, P = 0.0002).

lg [ki(КЭ)/ki(НТЭ)] = (0.59 ± 0.13) + (0.71 ± 0.09) Ур — (0.12 ± 0.02)(Ур)2.

Эти уравнения описывают изменение потенциального вклада вторичных мишеней, БХЭ и КЭ, в формирование отставленной нейротоксичности TFL с изменением гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы.

Как видно из Рисунка 3.1.-7, связывание с КЭ и особенно с БХЭ может существенно снижать степень взаимодействия с НТЭ для TFL с короткими R (Me, Et). С ростом гидрофобности алкильных радикалов снижается ингибиторная селективность TFL в отношении БХЭ и КЭ в сравнении с НТЭ, при этом линейно возрастает нейропатичный потенциал соединений (RIP) (ур-е 11). Таким образом, с ростом гидрофобности алкильных радикалов снижается защитная роль эстераз-скэвенджеров в формировании отставленной нейротоксичности, и соответственно возрастает нейропатичная опасность соединений.

Полученные результаты согласуются с известными экспериментальными данными о низкой способности вызывать ОНТФОС у соединений с короткими R (Me, Et) и возрастающей нейропатичности у соединений с длинными гидрофобными радикалами [190, 262, 273, 282, 299, 476].

Таким образом, анализ эстеразного профиля показывает различное влияние связывания TFL с неспецифическими эстеразами — КЭ и БХЭ на формирование острой и отставленной нейротоксичности: с увеличением гидрофобности молекулы наблюдается повышение защитного эффекта в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении способности соединения вызывать ОНТФОС. Аналогичный эффект наблюдался для близких по структуре О-фосфорилированных 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанолов (RO)2P (O)OCH (CF3)2, (PFP), ранее изученных в нашей лаборатории [455].

Как видно из полученных результатов, анализ эстеразного профиля позволяет сделать прогнозы о потенциальных терапевтических свойствах и нейротоксических эффектах соединений. Так, TFL с короткими алкильными радикалами (R=Me, Et) обладают низкой острой токсичностью и имеют низкий нейропатичный потенциал (RIP = 0.038 и 0.046); их высокая селективность в отношении эстераз-скэвенджеров, особенно в отношении БХЭ по сравнению с НТЭ, позволяет предположить дополнительный защитный эффект, снижающий вероятность развития ОНТФОС на уровне целого организма. Все это позволяет рассматривать данные соединения в качестве потенциальных антихолинэстеразных терапевтических средств, у которых отсутствует такой опасный побочный эффект как способность вызывать отставленные полинейропатии.

В то же время гидрофобные TFL с длинными алкильными радикалами (Bu, Pent), безопасные с точки зрения острой токсичности, обладают высоким нейропатичным потенциалом (высокие значения RIP) при сниженной защитной функции КЭ и БХЭ (низкие значения ki(БХЭ)/ki(НТЭ) и ki(КЭ)/ki(НТЭ)) и таким образом представляют опасность как отставленные нейротоксиканты. Это исключает их применение в качестве терапевтических средств. ингибирование ацетилхолинэстераза метаболизм липид Следует отметить, что оценка эстеразного профиля антихолинэстеразного лекарственного препарата, дающая более полную информацию о его взаимодействии с другими ферментами-мишенями, позволяет оценить также нежелательные лекарственные взаимодействия, обусловленные перекрестной специфичностью лекарственного соединения, и, соответственно, возможные опасные побочные эффекты препарата [482]. Так, недавно было обнаружено, что ингибиторы АХЭ и БХЭ, применяемые в терапии болезни Альцгеймера, способны также снижать активность КЭ, определяющую метаболизм лекарственных препаратов со сложноэфирными группами. В частности, ривастигмин длительно ингибирует активность КЭ1 почти на 80% и КЭ2 более чем на 95%, такрин способен снижать активность КЭ2 практически на 60%. Т. е. применение этерифицированных лекарственных препаратов в сочетании с данными ингибиторами холинэстераз может привести к снижению скорости гидролиза таких препаратов, тем самым изменяя их эффективность [483].

Учет перекрестной специфичности путем анализа полного эстеразного профиля потенциальных лекарственных соединений и ее минимизация путем создания ингибиторов, селективных только в отношении целевой эстеразы, являются существенным фактором при применении ингибиторов холинэстераз в качестве терапевтических агентов и при конструировании новых лекарственных соединений.

Таким образом, на примере О-фосфорилированных этилтрифторлактатов показано, что анализ эстеразного профиля соединений позволяет получить более полную картину их потенциальных биологических эффектов, тем самым оценить терапевтический потенциал и возможные побочные эффекты исследуемых соединений, а также позволяет получить информацию о механизмах формирования токсичности. Полученные результаты представляют несомненный интерес для конструирования нетоксичных селективных ингибиторов АХЭ, БХЭ и КЭ как потенциальных терапевтических агентов.

— получен эстеразный профиль для ряда гомологичных О-фосфорилированных этилтрифторлактатов путем определения бимолекулярных констант ингибирования в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ; - определены величины констант Михаэлиса для ингибирования НТЭ.

(Ka, M) и константы фосфорилирования (k+2, мин-1). Показано, что ингибиторная активность TFL в отношении НТЭ определяется эффективностью связывания фермента с соединением, причем связывание TFL в активном центре НТЭ носит экстракционный характер и улучшается с увеличением гидрофобности соединений;

проведен анализ эстеразного профиля TFL с построением количественных моделей Хэнча структура-ингибиторная активность и структура-селективность;

показана более высокая ингибиторная активность TFL в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с мишенями острой (АХЭ) и отставленной (НТЭ) нейротоксичности;

получены уравнения, описывающие зависимость нейропатичного потенциала TFL от гидрофобности. Показано, что нейропатичный потенциал соединений линейно возрастает с увеличением гидрофобности молекулы;

количественный анализ связи структура-селективность БХЭ/АХЭ, КЭ/АХЭ, БХЭ/НТЭ и КЭ/ НТЭ показал различное влияние связывания TFL с неспецифическими эстеразами (КЭ и БХЭ) на формирование острой и отставленной нейротоксичности: с увеличением гидрофобности наблюдается повышение защитного эффекта в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении способности соединения вызывать ОНТФОС;

— показана невысокая острая токсичность изученных TFL, имеющая тенденцию к снижению для более гидрофобных соединений.

Выбор соединений для исследований на тканях и на целом животном

Мы полагаем, что эстеразный профиль антихолинэстеразного соединения в значительной степени определяет его поведение на уровне тканей и целого организма. Для проверки этой гипотезы было необходимо исследовать ингибиторную активность ФОС с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ на препаратах тканей мышей (кровь и мозг) и на целом животном.

Для выбора наиболее подходящих соединений мы провели сравнительный анализ эстеразных профилей двух гомологичных рядов диалкилфосфатов: изученных в настоящей работе О-фосфорилированных этилтрифторлактатов (TFL) и исследованных ранее в нашей лаборатории структурных аналогов TFL — О-фосфорилированных 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанолов (PFP) общей формулы (RO)2P (O)OCH (CF3)2.

Наиболее подходящими кандидатами для исследования на тканях и на целом животном являются диэтили дибутилфосфаты, отличающиеся по гидрофобности, величине нейропатичного потенциала, селективности эстераза-скэвенджер/эстераза-мишень и острой токсичности для мышей.

В настоящей работе мы определили острую токсичность diBu-PFP (мыши CD1, в/бр, 24 часа) и воспроизвели ранее полученные данные по острой токсичности diEt-PFP [455]. В Таблице 3.1. 4 для сравнения приведены данные по ингибиторной активности и селективности этильных и бутильных производных PFP и TFL в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ (отношения соответствующих ki), а также острая токсичность соединений.

Таблица 3.1. — 4. Ингибиторная активность (ki, М-1мин-1), ингибиторная селективность производных PFP и TFL в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и острая токсичность соединений.

Как видно из Таблицы 3.1.-4, этильное и бутильное производные PFP обладают бульшими различиями в ингибиторной активности и селективности в отношении большинства исследуемых эстераз и бульшими различиями в острой токсичности по сравнению с производными TFL. diEt-PFP имеет очень низкий нейропатичный потенциал RIP = 0.052, умеренную острую токсичность LD50 = 200 (161.1ч238.9) мг/кг, и проявляет высокую селективность в отношении эстераз-скэвенджеров БХЭ и особенно КЭ по сравнению с НТЭ, в то время как более гидрофобный diBu-PFP является потенциально опасным отставленным нейротоксикантом (RIP = 4.99), обладает очень низкой острой токсичностью (LD50 > 2000 мг/кг) и проявляет высокую селективность в отношении БХЭ и особенно КЭ по сравнению с АХЭ.

Эти факты послужили основанием выбора пары соединений diEt-PFP -(С2H5O)2P (O)OCH (CF3)2 и diBu-PFP — (С4H9O)2P (O)OCH (CF3)2 для дальнейших исследований на тканях и на целом животном.

Мы также включили в исследования на тканях и на целом животном известное нейропатичное соединение — О, О-дипропил-О-дихлорвинилфосфат (diPr-DClVP), которое детально изучено in vitro и in vivo на курах и крысах в предыдущих работах нашей лаборатории [306, 484]. diPr-DClVP, обладающий как антихолинэстеразными свойствами, так и способностью вызывать отставленную нейротоксичность [296, 306, 484, 485], будет использован в наших последующих экспериментах в качестве маркерного соединения.

Оценка эстеразного профиля О-фосфорилированных гексафторизопропанолов (diEt-PFP, diBu-PFP) и маркерного соединения О, О-дипропил-О-дихлорвинилфосфата (diPr-DClVP)

Перед проведением экспериментов на препаратах мозга и крови мы воспроизвели полученные ранее данные [64, 455], по эстеразному профилю ресинтезированных diEt-PFP и diBu-PFP, охарактеризовали эстеразный профиль diPr-DClVP и оценили его острую токсичность для мышей: LD50 = 15.

Для удобства сравнения полученных данных с результатами экспериментов на препаратах мозга и крови мышей, величины полученных констант ингибирования (ki, M-1мин-1) исследуемых соединений в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мы пересчитали на величины IC50 (М). Для расчета использовали соотношение: IC50 = (ln2)/(kiЧt), где t — фиксированное время инкубации с ингибиторами (20 мин) [81]. Результаты приведены.

Таблица 3.1. — 6. Ингибиторная активность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ БХЭ, КЭ, представленная величинами IC50 (эстеразный профиль соединений).

При использования величин IC50 расчет селективности вели в соответствии с соотношением:

S (Ex/Ey) = ki (Ex) / ki (Ey) = IC50(Ey) / IC50(Ex).

Величины ингибиторной селективности исследуемых соединений в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ и величины LD50 приведены в Таблице 3.1. 7.

Таблица 3.1. — 7. Ингибиторная селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и острая токсичность соединеий (мыши, в/бр, 24 часа).

Наши результаты хорошо соответствуют ранее полученным и опубликованным данным [455]. Из Табл. 3.1.-7 видно, что diEt-PFP имеет очень низкий нейропатичный потенциал (RIP = 0.07), умеренную острую токсичность, LD50 = 200 мг/кг, и проявляет высокую селективность в отношении эстераз-скэвенджеров БХЭ и КЭ по сравнению с НТЭ. В то же время гидрофобный diBu-PFP является потенциально опасным отставленным нейротоксикантом (RIP = 6.6), обладает очень низкой острой токсичностью (LD50 > 2000 мг/кг) и проявляет высокую селективность в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ. diPr-DClVP является наиболее активным ингибитором всех исследуемых эстераз, имеет высокий нейропатичный потенциал (RIP=3.5) и высокую острую токсичность, LD50 = 15 мг/кг.

Таким образом, соединения, выбранные для исследований на тканях in vitro и на уровне целого организма, обладают различным эстеразным профилем, различным нейропатичным потенциалом и разной острой токсичностью.

Мы полагаем, что биологические эффекты указанных соединений, предсказанные на основании анализа их эстеразного профиля, будут проявляться на уровне тканей и целого организма.