Контроль персистенции вируса болезни Акабане в культуре клеток VERO с помощью прямого метода имунофлюоресценции

Болезнь Акабане — зоонозная, арбовирусная болезнь крупного рогатого скота, овец и коз, характеризующаяся абортами, нарушениями эмбрионального развития плода, преждевременными родами и рождением мертвых или уродливых плодов (синдром врожденного артрогрипоза-гидроэнцефалита), наносящая значительный экономический ущерб странам, где она имеет или имела место распространения (Япония, Корея, Тайвань, Австралия, Турция, Израиль, Сирия, Кипр, Африка).

В связи с закупкой фермерами Российской Федерации скота из стран дальнего зарубежья, а также многообразием и разносторонностью политических, культурных, туристических связей с ближним и дальним зарубежьем, не исключен занос на территорию РФ возбудителей экзотических инфекций, в том числе болезни Акабане. Наличие этой болезни в Турции создает потенциальную угрозу заноса возбудителя в Грузию и далее на территорию нашей страны.

Вирус болезни Акабане передается через клещей и комаров, что обеспечивает создание стойких природных очагов в суровых климатических условиях и создает возможность расширения круга позвоночных хозяев. Длительное сохранение вирусной популяции среди восприимчивых позвоночных способствует быстрому распространению среди диких и домашних животных в благоприятный для кровососущих насекомых климатический период.

В отношении возможной патогенности вируса для человека имеется единичное сообщение в Международном каталоге арбовирусов (1975 г.).

Вирус болезни Акабане относится к роду Orthobunyavirus семейства Bunyaviridae, серологической группы Симбу, в которую входят вирусы болезней Шмалленберг (первая вспышка болезни в Западной Европе в 2011 г.), Айно, Шамонда. Геномы последних имеют сходство с геномом вируса болезни Акабане (вирус впервые был изолирован от комаров Culex triaeniorhynchus в 1959 году в Японии в эпизоотическом очаге) [1].

Поэтому при постановке диагноза необходимо дифференцировать болезнь Акабане от выше перечисленных болезней и от других клинически сходных заболеваний: болезни Найроби, лихорадки долины Рифт, болезни Ибараки, блютанга.

Для первичного выделения вируса болезни Акабане из патологического материала используют одно-двухдневных белых мышей-сосунков, которые представляют собой наиболее чувствительную систему для изоляции всех буньявирусов. Для выделения вируса отбирают пробы патологического материала от плодов абортировавших животных: мозга, лимфоузлов, селезенки, почек, скелетных мышц, плаценты, крови.

Из проб органов готовят 10% суспензии на физиологическом растворе с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В), выдерживают 30 минут при 37оС, центрифугируют, затем используют надосадок для интрацеребрального заражения мышей-сосунков.

Суспензию мозга больных и павших мышей-сосунков используют для заражения чувствительных к вирусу болезни Акабане первичных и перевиваемых культур клеток животных. Идентификацию вируса болезни Акабане проводят методом иммунофлуоресценции [2].

Вирус болезни Акабане может персистировать как в организме животных, так in vitro в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (СV-1), почки сибирского горного козерога (ПСГК), почки эмбриона африканской козы (ПЭАК) [3]. В культуре клеток CV-1 вирус Акабане вызывает цитопатические изменения, выражающиеся в округлении клеток с последующим цитолизом и отслоением клеточного монослоя через 48 часов после заражения [4].

Цель исследований

Целью настоящей работы явилось изучение возможности использования перевиваемой линии клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO) для быстрого обнаружения антигена вируса болезни Акабане методом иммунофлюоресценции.

Материалы и методы В работе использовали вирус болезни Акабане, шт. 8935 и общепринятый в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии метод заражения культур клеток вирусами болезней животных.

Для идентификации антигена вируса использовали прямой метод флуоресцирующих антител, который быстро выполним, чувствителен, специфичен и является доступным методом лабораторной диагностики при выявлении антигенов вирусов в культурах клеток и поэтому широко используется в ветеринарной практике. Методом флюоресцирующих антител специфический антиген может быть обнаружен в образцах клеточных культур, инфицированных исследуемым материалом. Схема реакции иммунофлюоресценции имеет одну динамическую фазу — фазу специфического узнавания антигена антителом. В основе метода лежит иммунологическая реакция между специфическим антигеном и антителами к нему, меченными флюорохромами.

Окраску клеток VERO, инфицированных вирусом болезни Акабане, проводили специфическим к данному вирусу ФИТЦ-конъюгатом из «Набора препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики болезни Акабане» производства ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии г. Покров.

ФИТЦ-конъюгаты получали из иммуноглобулинов G, выделенных из иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) мышей с помощью афинной хроматографии на Протеин-А-Сефарозе. Данный метод очистки иммуноглобулинов гарантировал достаточно высокую специфичность МФА, степень очистки и устойчивость к химическим и физическим воздействиям в процессе конъюгирования. В качестве флюорохрома мы использовали флюоресцеинизотиоционат.

Одно-двухдневных мышей-сосунков заражали интрацеребрально вирусом болезни Акабане (10%-ная суспензия мозга мышей), полученным из лаборатории Музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров. Клинические признаки, характерные для вирусов семейства Bunyaviridae (потерю рефлекса сосания, параличи и гибель) наблюдали с первого пассажа.

Павших через сутки мышей-сосунов уничтожали, т.к. это может быть не специфический падеж, а реакция на введенный материал. От больных и павших через двое суток после заражения вирусом болезни Акабане мышей-сосунков отбирали мозг, который замораживали при температуре минус 600С, затем размораживали.

Из мозга больных и павших мышей-сосунков готовили 10%-ную суспензию и десятикратным разведением (10−1) данного материала заражали перевиваемую линию клеток почки африканской зеленой мартышки.

Культуру клеток VERO выращивали в среде Игла-МЕМ с 10% сыворотки крови плода КРС в 96-луночных полистироловых панелях производства «Сostar» и отечественного производства.

После суток инкубации состояние культуры клеток оценивали под световым инвертированным микроскопом и при формировании сплошного монослоя в лунки панелей вносили, предварительно удалив ростовую среду, по 100 мкл десятикратного разведения (10−1) на среде Игла МЕМ 10%-ной суспензией мозга мышей-сосунов, содержащей вирус болезни Акабане, шт. В 9835 (7,2 lg МЛД 50/мл) и среду Игла МЕМ. В ряд лунок с культурой клеток VERO вносили вируссодержащий материал, в ряд — среду Игла МЕМ, так 6 повторов.

На время контакта (1,5 — 2 часа) мозговой суспензии с культурой клеток VERO панели помещали в СО2 инкубатор с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и 90% относительной влажности. После контакта инокулированную жидкость удаляли стряхиванием, монослой клеток в панелях промывали 1−2 раза средой Игла МЕМ с добавлением антибиотиков и опять удаляли стряхиванием.

В каждую лунку вносили 150 мкл поддерживающей среды Игла МЕМ и помещали панели в СО2 инкубатор.

Через каждые сутки, начиная с первых, отбирали по одной панели, стряхиванием удаляли поддерживающую среду, высушивали монослой культуры клеток VERO, фиксировали 20% раствором охлажденного ацетона и опять высушивали. Эту процедуру повторяли в течение трех суток. Высушенные панели до обработки ФИТЦ-конъюгатом хранили при температуре минус 600С.

После разморозки панели подсушивали при комнатной температуре в течение 30−40 минут, затем в лунки вносили по 50 мкл ФИТЦ-конъюгата в рабочем разведении, охватывая лунки с зараженной и интактной культурой клеток, инкубировали при температуре 370С в течение 30 минут. Затем конъюгат удаляли, клетки промывали физиологическим раствором (рH 7,2 — 7,4) путем внесения и удаления его из лунок 4−5 раз.

акабане вирус клетка мартышка.

Результаты исследований

Результаты идентификации вируса болезни Акабане в культуре клеток VERO фиксировали после наблюдения препаратов под инвертированным люминесцентным микроскопом.

Через 24 часа после инокуляции вируса болезни Акабане в культуру клеток VERO и после обработки инфицированных клеток ФИТЦ-конъюгатом наблюдали одиночные флюоресцирующие клетки (фото 1).

Фото 1. Культура клеток VERO через 24 часа после инфицирования вирусом болезни Акабане Через 48 часов после инокуляции вируса болезни Акабане в культуру клеток VERO и после обработки инфицированных клеток ФИТЦ-конъюгатом наблюдали группы флюоресцирующих клеток (фото 2).

Фото 2. Культура клеток VERO, через 48 часов после инфицирования вирусом болезни Акабане В интактной культуре флуоресценции не наблюдали (фото 3).

Отсутствие свечения в интактной (контрольной) культуре клеток VERO при обработке ее ФИТЦ-конъюгатом против болезни Акабане позволило нам судить о специфичности свечения в инфицированной культуре клеток VERO.

Фото 3. Интактная культура клеток VERO.

Необходимо отметить, что в течение 48 часов вирус болезни Акабане размножался в культуре клеток VERO без проявления цитопатических действий. Только через 60−72 часа культивирования наблюдали деструктивные изменения клеточного монослоя.

Выводы

После проведенных исследований мы сделали следующие выводы.

• 1. Культура клеток VERO чувствительна к вирусу болезни Акабане и пригодна для выявления антигена вируса болезни Акабане.
• 2. Прямым методом иммунофлуоресценции можно идентифицировать антиген вируса болезни Акабане в зараженной культуре клеток VERO на двое суток (48−60 часов) раньше, по сравнению с выявлением его по цитопатическому эффекту, что важно, т.к. раннее обнаружение вируса является залогом своевременного и эффективного развертывания системы профилактических мероприятий.

• 1. Isolation of arbor viruses from mosquitoes collected at live-stock pens in Gumma Prefecture in 1959 / Matumoto M., Oya A., Ogata T., Kobayashi I., Nakamure T., Takahashi H., Kitaoka M. // Jap. J. Med. Sci. Biol. -1960. -V.13. -P.191−198.
• 2. Диагностика болезни Акабане методом флюоресцирующих антител / И. Ф. Вишняков, Е. А. Балашова // Информационный бюллетень 1994. ИЭКВМ. -Харьков, 1995. -С.52.
• 3. Чувствительность перевиваемых линий культур клеток к вирусу болезни Акабане / Е. А. Балашова, И. Ф. Вишняков, Г. Н. Чурбанова, С. А. Витина. // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ 13−18 апреля 1992 г. -Покров, 1992. -Ч.1. -С.142.
• 4. Изучение цитопатического эффекта, вызываемого вирусом Акабане, в перевиваемой культуре клеток CV-1 / Н. В. Черных, Е. А. Балашова, И. Ф. Вишняков, С. А. Витина, С. Ф. Чевелев // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ 13−18 апреля 1992 г. -Покров, 1992. -Ч.1. -С.140−141.